Nature重磅：AAV递送CRISPR，体内改造B细胞，产生广泛中和抗体治疗艾滋病

艾滋病（AIDS），即获得性免疫缺陷综合征，是一种由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的危害性极大的传染病。HIV 病毒把人体免疫系统中最重要的 CD4+T 细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，经过数年、甚至长达10年或更长的潜伏期后发展成艾滋病病人，使人体丧失免疫功能，因抵抗力极度下降会出现多种感染，后期常常发生恶性肿瘤，以至全身衰竭而死亡。

在过去的几十年里，何大一等人提出的“鸡尾酒疗法”等联合治疗方案使得艾滋病成为了一种相对可控的慢性疾病，HIV 感染患者的存活时间和生活质量也得到了极大的改善。然而，这些疗法只能抑制患者体内的 HIV 病毒，而不能彻底清除，因此也就无法治愈。

据联合国艾滋病规划署数据，目前全球范围内现存HIV携带者和艾滋病患者人数高达3800万人，且数量仍在快速增长中。

近日，以色列特拉维夫大学的研究人员在 Nature Biotechnology 期刊上发表了题为：In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice 的研究论文。

该研究使用两种腺相关病毒载体（AAV）同时递送 CRISPR-Cas9 基因编辑系统和靶向免疫球蛋白基因的修复模板，直接编辑小鼠内源 B 细胞的免疫球蛋白基因位点，有效地在体内修饰 B 细胞，使之能产生针对 HIV 病毒的中和抗体，让一次性注射治疗艾滋病成为可能。

多年以来，科学家们在治疗 HIV 感染时一直面临一个十分棘手的问题——HIV 在人体中变异迅速，极易产生耐药性。令人兴奋的是，2011年 Michel Nussenzweig 团队在一名 HIV 感染者体内分离出了一种 HIV 广泛中和抗体——3BNC117。

然而，尽管针对 HIV 的强效、广泛中和抗体（bNAb）可以保护机体免受感染，但众多的艾滋病候选疫苗的临床试验最终无一不以失败告终，这提示我们想要通过传统的免疫方法实现对 HIV 的免疫是十分困难甚至是不可能的，必须走出新的道路。

对此，如果能通过 CRISPR 技术直接编辑免疫球蛋白基因来重编程体液免疫，使之产生靶向特定病原体（如HIV病毒）的中和抗体，那将是一种里程碑式的革新。

在这项最新研究中，研究团队设计了两种重组腺相关病毒（AAV）：一种编码 CRISPR-Cas9 基因编辑系统，包括 CMV/SFFV 启动子驱动的 SaCas9 和 U6 启动子驱动的 sgRNA；另一种编码靶向免疫球蛋白基因的 HIV-bNAb-3BNC117 同源性定向修复模板（HDRT）。

两种重组腺相关病毒递送CRISPR-Cas9基因编辑系统和HDRT

研究人员使用各种 HIV 包膜糖蛋白（Env）为基础的免疫原免疫小鼠，以扩大激活细胞的数量，6天后通过静脉注射将这两种重组 AAV 地送到小鼠体内。经过几次相同的 HIV-Env 增强免疫后，小鼠的血清中开始表达广泛中和抗体，并且可以中和 3BNC117 敏感的 HIV 毒株。

免疫小鼠产生3BNC117

紧接着，研究团队通过高通量测序分析了基因编辑效果。正如预期的那样，早期可在小鼠的肝脏和血液中发现 AAV 基因组的强烈富集，随着时间的推移，在肝脏中 AAV 拷贝数减少，而在免疫小鼠的淋巴结和骨髓中增加，这表明在这些组织中B细胞克隆扩增正在进行。

注射AAV后130天，在免疫小鼠的淋巴组织中发现了体内工程B细胞

研究小组还通过 CHANGE-seq 评估了脱靶编辑的程度，结果显示，95%的 Cas9 诱导的切割是靶标特异性的，并且所有主要脱靶编辑位点都位于基因间或内含子区域。

为了防止在在细胞中的脱靶编辑，研究团队等将驱动 Cas9 表达的 CMV/SFFV 启动子替换为B细胞特异性 CD19 启动子。除此之外，他们还将编码 gRNA 的元件转移到含 HDRT 的 AAV 中，这样只有同时转导了两种 AAV 的细胞才能被编辑。这种新设计在保持编辑效率和血清抗体水平的同时，显着降低了肝脏中的 Cas9 表达和非特异性切割。

脱靶切割分析显示了较高的安全性

总而言之，这项研究开发了一种实现 HIV 免疫的新方法——通过 CRISPR 技术直接编辑免疫球蛋白基因来重编程体液免疫，诱导免疫系统产生对抗 HIV 的广泛中和抗体——3BNC117，中和 3BNC117 敏感的 HIV 毒株。

研究模式图

当然，这项技术的实现还存在许多障碍：抗体滴度仍要更高、更稳定才能确保治疗效果和减少免疫接种次数；需要结合多种互补的广泛中和抗体（bNAbs）提高对 HIV 的免疫预防；在没有加强免疫的情况下，这些抗体反应是否持续尚不清楚；以及最重要的安全性问题，是否会引起不良免疫反应，是否会导致 AAV 染色体随机整合驱动的致癌事件。

尽管如此，这项研究成果仍是令人兴奋，它表明直接基因编辑B细胞从而产生特异性广泛中和抗体（bNAbs）将成为缺乏有效疫苗的传染性疾病的潜在治疗方案。研究团队表示，预计在未来几年内，将能以这种方式生产治疗艾滋病、其他传染病和某些由病毒引起的癌症（如宫颈癌、头颈癌）的药物。

原始出处：

Nahmad， A.D.， Lazzarotto， C.R.， Zelikson， N. et al. In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. Nat Biotechnol (2022). https：//doi.org/10.1038/s41587-022-01328-9.