基于石墨烯传感器阵列的呼气分析在肺癌筛查与诊断中的应用：一项4 580例样本的前瞻性队列研究

 摘  要 

目的　探索基于呼出气体分析的新型肺癌早期筛查方法。方法　 纳入2023年9月—2024年6月期间在浙江大学医学院附属邵逸夫医院庆春和钱塘院区就诊并且诊断可能为肺恶性肿瘤的患者以及于体检中心参加体检的健康人群，将入组受试者分为肺癌组、良性结节/肿瘤组、空白对照组。采用多种石墨烯复合材料构建的呼气指纹阵列传感器收集受试者呼出气，基于所得数据，构建肺癌筛查与诊断模型，并评估其效能。结果　共纳入4 580例受试者，其中病理诊断为肺恶性肿瘤的受试者3 195例［男1 394例、女1 801例，平均年龄（58.93±12.37）岁］，病理诊断为良性结节/肿瘤组的受试者599例［男339例、女260例，平均年龄（57.10±11.06）岁］，经胸部CT检查未见肺结节的空白对照受试者786例［男420例、女366例，平均年龄（29.75±9.32）岁］。训练集4 031例，外部测试集549例。肺癌高危人群筛查模型（区分肺癌/高危肺结节患者与健康人群）效能优异：受试者工作特征曲线下面积（area under the curve，AUC）达0.926；当约登指数最大（阴阳性划分阈值63.5%）时，外部测试集特异性85.2%、敏感性88.4%、准确度86.8%。肺癌诊断模型（区分肺癌/癌前病变患者与良性肺结节/健康人群）AUC 达0.818；约登指数最大（阈值47.0%）时，外部测试集特异性71.7%、敏感性77.3%、准确度74.5%。结论　本研究构建的基于传感器阵列的非侵入式呼气检测平台，通过分析呼气指纹，可实现快速、较精准的肺癌筛查，证实了该技术用于肺癌早期筛查的可行性，有望促进肺癌的早期发现与干预。

正  文

肺癌目前已成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。2022年流行病学统计显示，我国新发肺癌病例约为106.06万例，死亡病例约为73.33万例[2]。肺癌在总人群中居恶性肿瘤发病率之首，尤其在男性中肺癌发病率为结直肠癌（发病率排名第2的恶性肿瘤）的2倍以上[2]。虽然现有的外科手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种治疗手段已使肺癌患者的生存率和预后取得了显著改善[3]，但肺癌的高发病率和高致死率仍未根本改变。早期筛查和诊断是肺癌治疗策略的关键，是改善患者预后的重要途径，更是降低肺癌患者死亡率的重中之重。

呼出气体作为反映人体整体代谢活动及微生物群代谢状态的重要介质，与人体整体代谢活动及微生物群的代谢密切相关[4]。呼出气体主要来源于肺部顶层气体，通过体循环和肺循环的动态交换，反映机体的代谢状态，包含了丰富的生理信息[5]。由于肺结节位于呼吸道内部，呼出气体检测能够提供关于肺组织状态最直接的实时反馈，在检测频率、成本控制以及样本采集方面具有显著优势。过去数十年间，基于气相色谱-质谱联用技术（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）与模式识别算法的分子水平分析[6]表明，健康个体与肺癌患者之间的呼气指纹存在显著差异。这些差异可能源自以下因素：（1）传导气道和肺泡内源性代谢产生的挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs）；（2）吸入后被呼出的外源性挥发物或来自共生微生物的代谢产物；（3）在身体其他部位生成后通过血液运输至肺部的代谢产物。

GC-MS作为挥发性化合物鉴定的金标准，凭借其高特异性在代谢产物分析领域占据重要地位，但其设备复杂、操作繁琐、检测耗时等局限性使其难以满足临床快速筛查与辅助诊断的需求[7]。与之相比，电子鼻（eNose）作为一种新兴的呼吸分析技术，有响应速度快、成本低廉、使用便捷等优点，为无创呼吸分析开辟了新思路[4]。与传统旨在识别单一挥发物的相关技术不同，电子鼻通过传感器阵列结合模式识别算法，能够提取与疾病状态相关的整体呼吸特征。近年来，已有多项研究[8-12]尝试采用电子鼻检测肺癌患者的呼吸模式，初步提示其潜在的诊断能力。然而，这些研究多因小样本量，缺乏外部验证，且尚无临床研究明确证实能有效区分肺结节亚型的完全无创的呼吸分析。石墨烯基纳米材料因其优异的气体传感性能，其电荷转移和电子隧穿机制使其能够检测痕量水平的无机及有机气体，在以往研究[13]中表现出显著优势。当结合模式识别算法使用时，电子鼻在分析复杂气味特征方面尤为出色。本课题组此前利用此类传感器阵列在呼吸系统疾病及幽门螺杆菌相关胃肠道疾病的检测中取得了良好结果[14–16]。

基于上述研究基础和前期成果，本研究开发了一套集成便携式电子鼻系统的呼吸分析平台，该平台以石墨烯基气体传感器阵列为核心，开展肺癌疑诊患者及健康个体的临床研究入组，采集呼气数据、结合病理学金标准建立呼气指纹数据库，通过统计学、机器学习及神经网络的算法分析，评估肺癌诊断和筛查的区分性能，并建立相应诊断、筛查模型，探索呼气检测作为早期肺癌筛查的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1   研究对象

本研究为前瞻性队列研究，于2023年9月—2024年6月期间纳入在浙江大学医学院附属邵逸夫医院庆春和钱塘院区就诊并且诊断可能为肺恶性肿瘤的患者以及于体检中心参加体检的健康人群。

所有受试者纳入标准：（1）年龄≥18周岁；（2）诊断可能为肺恶性肿瘤的患者或者于体检中心参加体检的健康人群；（3）自愿参加本研究，并签署知情同意书。病理阴性对照及病理阳性试验队列受试者纳入标准：（1）胸部CT检查发现肺部结节或肿物且临床诊断考虑恶性肿瘤，需入院进一步明确诊断；（2）患者入院后行支气管镜活检/CT引导下肺穿刺活检/外科手术并取得病理诊断，同时具备完善的临床信息，包括年龄、性别、身高、体重、吸烟史、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）病史、肿瘤家族史、肺癌临床分期或病理分期、有无肺部感染及合并症等；（3）出院后愿意配合医院进行随访。空白对照队列受试者纳入标准：（1）体检患者；（2）胸部CT检查未见肺部病灶，临床无肺恶性肿瘤诊断依据；（3）具备完善临床信息，包括年龄、性别、身高、体重、吸烟史、COPD病史、肿瘤家族史、有无肺部感染及合并症等；（4）愿意配合医院进行随访。

排除标准：（1）同时患有严重的系统性疾病（包括严重缺血性心肌病、恶性心律失常、难以控制的癫痫、重度COPD、严重肺部感染、其他恶性肿瘤等）；（2）未获得明确病理结果者，或临床核心资料缺失无法用于分析者（空白对照组默认为病理阴性）；（3）无法配合呼出气体采样并取得有效呼气指纹样本；（4）弱势群体，包括精神疾病者、认知损伤者、危重患者、未成年人、孕妇等。

1.2   分组

将入组受试者分为肺癌组（A组），良性结节/肿瘤组（B组），空白对照组（C组）。在数据分析阶段发现，部分良性结节/肿瘤组患者在未行手术或者活检的部位仍然存在磨玻璃结节，由于此类磨玻璃结节在一定程度上可能为癌前病变或早期肺癌，故将良性结节/肿瘤组进一步细分为3个亚组：（1）良性结节伴磨玻璃结节组（B-0组）：同时存在病理证实良性结节与残留磨玻璃结节的患者；（2）癌前病变组（B-1组）：病理证实癌前病变患者；（3）良性结节不伴磨玻璃结节组（B-2组）：纳入经胸部CT确认除病理明确的良性结节/肿瘤外无任何磨玻璃结节的患者；见图1。

图1　训练集筛查模型和诊断模型受试者的分组方法

本研究主要构建了2个模型：肺癌高危人群筛查和诊断模型。（1）肺癌高危人群筛查模型的目的是在高危人群的体检中使用，将有可能需要进一步检查的肺结节鉴别出来。故在分组上，将存在肺结节/肿物的肺癌组（A组）和良性结节/肿瘤组（B组）纳入试验组；空白组（C组）纳入对照组。筛查能力的指标应对照胸部CT有所提升，具备较高的灵敏度。（2）肺癌诊断模型的目的是将可能存在肺癌风险的结节有效地鉴别出来（可能需要进一步治疗的患者），故试验组为肺癌+癌前病变的患者。数据中排除了良性结节伴磨玻璃结节组（B-0组），因为这些患者中的少部分结节可能已经是肺癌。剩下的良性结节不伴磨玻璃结节和空白组纳入了对照组。该诊断模型应可以将良性结节和无结节的人群与肺癌风险的结节有效地区别，以帮助临床进行诊断，诊断模型应具备较高的特异性。

1.3　呼气指纹传感器的设计和制作

本研究中，气体的采集和初步分析主要使用本课题组研发的呼气指纹检测仪，其核心由3部分组成：气体采集模块、气体传感芯片和气体检测仪[15]。气体采集模块为独立标准化组件，当呼出气体CO2浓度>3.5%时，标准化地采集受试者的气体。气体传感芯片是一种石墨烯复合材料，能够同时对微量、痕量无机气体及VOCs产生高灵敏度响应。气体检测仪为气体传感芯片的载体，通过湿度、温度控制程序对气体进行预处理，读取芯片对在气体通过时产生的各位点电阻值与时间的关系，进而输出时间-电阻响应曲线。

气体传感芯片的气敏材料是本课题组在前期工作中制作。将等体积石墨烯溶液和不同金属氯化盐溶液（氯化钴、氯化铁、氯化铜、氯化铈）相互混合，实现不同比例金属离子诱导的石墨烯自组装，得到8种石墨烯复合材料前驱体，制成的石墨烯气体传感芯片对应于上述8种石墨烯复合材料前驱体，分别标记为HXS001～HXS008[16]，构建成8通道阵列传感器（HXS00X）；见图2。

图2　气体阵列传感器制作流程图

a：准备气敏材料；b：点样；c：形成气敏芯片及芯片实物图。

1.4　观察指标及采集流程

观察指标：（1）基本信息：包括年龄、性别、身高、体重、吸烟史、COPD病史、肿瘤家族史、有无肺部感染及合并症等；（2）影像学检查：胸部CT检查；（3）病理报告：活检或手术的病理报告，肺癌TNM临床分期或病理分期。

采集流程：受试者签署知情同意书后，本研究组通过气体采集模块控制呼出气体CO2浓度，收集约1～2 L的气体，其中对于要进行支气管镜活检/穿刺活检/手术的患者，在相应诊疗前采集。对于参与体检的受试者，在体检中心进行胸部CT检查后进行采集。同时记录受试者的相关临床资料和采集相关的资料（采集模块、采集时间、采集地点和呼出最高CO2浓度），数据使用队列研究管理软件维护与记录。受试者呼出气体采集后，在当天对气体进行检测，通过呼气指纹检测仪中传感器检测得到对应采集呼气的电阻响应，构建传感器电阻-时间响应曲线。根据采集气体的量，通过不同呼气指纹传感器与检测仪进行1～2次测试。对于每一测试样本，提取传感器每个通道响应曲线在平行4次测定中的第二个测试曲线段，经响应值重构后形成响应值-时间动力学曲线，对每个通道的响应曲线数值等距离采样100个点，得到800（8×100）个特征值；见图3。

图3　呼出气体检测流程示意图

a：规范采集受试者呼出气体；b：呼气指纹检测仪气体检测；c：构建8 通道传感器电阻-时间响应曲线。

1.5　模型构建

深度学习框架使用Pytorch 2.0.3，并导入Numpy、Matplotlib、sklearn等深度学习库以方便训练。在输入模型训练前，所有传感器数据均进行标准差标准化，以消除传感器响应大小的影响。庆春院区数据用于模型的开发，而钱塘院区就诊患者的数据独立分配到外部测试集，批次大小设置为32、64和128，根据训练的效果选择。学习率设置为0.000 1。分别评估模型对于训练集和外部测试集的曲线下面积（area under the curve，AUC）值。模型使用多层感知机（multi-layer perceptron，MLP）。其中，激活函数使用线性整流函数（rectified linear unit，ReLU）；隐藏层的大小5、10、20、50、100，根据训练的效果选择；为防止模型过拟合，通过判断验证损失是否小于最佳验证损失丢弃概率进行早停，同时使用一定的丢弃概率随机丢弃一部分神经元（Dropout）；MLP的迭代次数（epoch）最大为500次；输入层数据的筛选使用了LogitNet方法。LogitNet是最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）回归和岭回归（ridge regression）的结合，通过交叉验证来选择最佳的alpha值。模型构建后使用AUC来评价模型的效能，并通过构建模型训练中的最佳点使用约登（Youden）指数计算敏感性、特异性、准确度。为了比较MLP模型和传统机器学习模型的差异性，本研究还计算了线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）、随机梯度下降法（stochastic gradient descent，SGD）、支持向量机（support vector machines，SVM）、极端梯度提升（eXtreme Gradient Boosting，XGBoost）4种机器学习模型和logistic回归的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。

1.6　统计学分析

病例数据分析使用 Python 3.10，表格数据处理使用 Pandas，统计分析使用 SciPy。正态分布的连续变量以均数±标准差（x±s）描述，两组比较采用双样本 t 检验；不符合正态分布的连续变量以中位数（上下四分位数）［M（P25，P75）］描述，两组比较采用 Wilcoxon U 检验。分类变量以频数（百分比）描述，两组比较采用χ2检验。病例数据中少量缺失值采用 K最近邻（K-nearest neighbor，KNN）填补。双侧 P≤0.05 为差异有统计学意义。

1.7　伦理审查

经浙江大学医学院附属邵逸夫医院医学伦理委员会审核通过，批件号：邵逸夫医院伦审2023研第0488号。

2 结果

2.1　入组和分组情况

本研究总投入了7台呼气指纹检测仪，共有6 930人次受试者参加。根据纳入和排除标准，共纳入4 580例受试者，其中病理诊断为肺恶性肿瘤的受试者为3 195例（训练集2 795例，外部测试集400例），病理诊断为良性肿瘤/结节的受试者为599例（训练集538例，外部测试集61例），经胸部CT检查未见肺结节的受试786例（训练集698例，外部测试集88例）。良性结节/肿瘤中癌前病变组110例（训练集103例，外部测试集7例），良性结节伴磨玻璃结节组85例（训练集84例，外部测试集1例），良性结节组404例（训练集351例，外部测试集53例）。

从训练集与外部测试集肺癌组患者的分布上看，因多院区入组患者分布的差异，在肿瘤类型、肿瘤大小、淋巴结转移、气道侵犯、确诊方式上存在一定的差异（表1）。在入组的受试者中，对各个肿瘤类型、肿瘤分期的患者均有覆盖。本研究的受试者大部分在胸外科门诊以及病房招募，故肺癌患者的分布以早期为多数。健康受试者的来源大部分来自在体检中心与门诊行胸部CT检查未见肺结节的人群。训练集和测试集筛查模型受试者基线特征见表2。

2.2　肺癌高危人群筛查模型的构建与验证

筛查模型通过LogitNet方法选出了22个参数输入MLP模型进行训练。MLP模型参数设置如下，批大小：128；隐藏层神经元数量：5；神经元丢弃概率：0.1；权重衰减：0.001；学习率：0.000 1；最大训练循环：100。经计算，训练集AUC=0.967，外部测试集AUC=0.926，最佳约登指数为0.737，此时，分类阴阳性概率阈值为63.5%、特异性85.2%、敏感性88.4%、准确度86.8%、F1分数86.8%、阳性预测值87.4%，阴性预测值 97.8%；见图4。

图4　筛查模型的区分性能

a：概率分布曲线及阈值；b：受试者工作特征曲线；c：亚组区分性能分布。

2.3　肺癌诊断模型的构建与验证

诊断模型通过LogitNet方法选出了14个参数输入MLP模型进行训练。MLP模型参数设置如下，批大小：265；隐藏层神经元数量：5；神经元丢弃概率：0.3；权重衰减：0.01；学习率：0.000 1；最大训练循环：500。经计算，训练集AUC=0.836，外部测试集AUC=0.818，外部测试集的最佳约登指数0.490，此时，分类得分值阈值为0.52、分类阴阳性概率阈值为47.0%、特异性71.7%、敏感性77.3%、准确度74.5%、F1分数74.4%。外部测试集下，当划分阴阳性概率阈值为60.4%时，特异性为85%、敏感性为68.9%；当划分阴阳性概率阈值为63.0%时，特异性在80%情况下，敏感性为71.2%；当划分阴阳性概率阈值为64.7%时，特异性在75%情况下，敏感性为74.0%；当划分阴阳性概率阈值为65.9%时，特异性在70%情况下，敏感性为77.0%；见图5。

图5　诊断模型的区分性能

a：概率分布曲线及阈值；b：受试者工作特征曲线；c：亚组区分性能分布。

2.4　神经网络与其他机器学习模型的对比

本研究中同时尝试了LDA、SGD、SVM、XGBoost 4种机器学习模型[17-18]和logistic回归，可以看到MLP模型的表现最佳；见表4。

３ 讨论

本研究基于团队自主研发的呼气指纹检测仪，开展了大规模的前瞻性临床研究。通过标准化采集和分析大量临床呼气样本，利用机器学习、神经网络等数据处理方法，构建并验证了肺癌筛查和诊断模型，并结合病理为金标准进行性能评估和验证。本研究的结果表明呼气指纹检测仪满足肺癌筛查的需求和基本满足诊断的要求。本研究入组样本包含各个分期、亚型的肺癌和各种不同类型的良性结节，兼具广泛性和个体差异性，更加表明通过呼气筛查肺癌的可行性，未来可以通过非侵入性方式，低成本和安全地进行肺癌的早期筛查。

在本次开展的研究中，所采用的呼气指纹传感器具备8个通道。每个通道中均提取了100个特征参数，总计生成800个特征参数。Kort等[9]的研究证明了加入一些临床指标可以提高传感器模型的能力。在分类模型中我们还纳入了受试者的年龄、性别、BMI以及吸烟情况。进一步，应用LogitNet方法（结合LASSO回归和岭回归）针对具有800个特征的数据集开展特征选择以及参数筛选的工作。LASSO回归[19]在高维数据方面能够显著地降低特征的数量，精准地识别出关键的变量。而岭回归则在稳定性以及避免过拟合的层面表现得极为出色。故在本研究之中，通过LogitNet方法为筛查模型留存了22个参数，为诊断模型留存了14个参数，并将其纳入MLP模型以展开训练。从而进一步简化模型，缩减样本量，使模型复杂性与数据量之间的关系达到平衡，这是保证MLP模型拥有出色泛化能力的关键要点。除此之外，在本研究当中，还借助正则化技术（L2正则化和Dropout）来降低过拟合发生的可能性。

目前临床上开展肺癌早期筛查中，低剂量计算机断层扫描（low-dose computed tomography，LDCT）仍处于中心地位，NLST的临床研究[20]表明，年度LDCT筛查较胸部X线片检查的相对死亡率降低20%。在我国，筛查组在肺癌死亡率及全因死亡率方面，较未筛查组分别降低了31.0% 和32.0%[21]。故进行肺癌的早期筛查是降低肺癌死亡率的重要手段。虽然LDCT的辐射较常规CT明显下降，但长期随访带来的辐射风险仍不可忽视[22]。NLST的研究[20]同时显示其假阳性率高达94.5%。每年大量患者被诊断出肺部结节，多数为良性，肺癌筛查使结节发现数量增多。患者确诊结节后常出现“接近癌症”的心理困扰[23]。这种假阳性的高发生率揭示了肺癌筛查方法的局限性，尤其是在早期阶段的肺癌诊断中，存在筛查测试的特异性和敏感性之间的平衡问题。尽管CT筛查能够有效发现潜在的肺癌病例，但假阳性率过高，可能导致患者过度检查、过度治疗，甚至外科手术治疗，进而影响患者的生活质量并造成医疗资源的过度利用。相较于传统 LDCT 筛查，呼气指纹筛查可在规避辐射风险的基础上，支持更密切的随访监测，从而减轻患者确诊肺结节后产生的相关困扰[22-23]。

肺癌早期筛查还可通过包括血清学蛋白肿瘤标志物、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、ctDNA、外泌体、miRNA等技术在内的液体活检技术[24-25]。本研究相较于血液、肺泡灌洗液更加无创；相较于血清学蛋白肿瘤标志物有明显的特异性和灵敏性的优势；相较于CTCs、ctDNA、外泌体和miRNA等传统检测方式[26]，在检测速度与经济性有优势；同时相较于ctDNA，具有更早期的筛查能力[27]。

在肺癌筛查和诊断模型中，呼气指纹检测表现出了良好的分类效果。但本研究仍有不足之处。本研究中大部分肺癌患者来源于胸外科住院患者，因目前肺癌开展早期治疗的现状，其疾病谱偏早中期，故Ⅲb～Ⅳ期的肺癌患者入组数量明显少于早期。在多中心研究上，目前仅在省内开展研究，存在一定的地域局限性，因此应积极拓展研究范围，与更多省外乃至全国的医院进行合作。

本研究通过大规模前瞻性临床研究，在真实临床场景中对呼气指纹检测仪的全流程性能进行验证，涵盖各病理分期、组织学亚型肺癌及不同类型良性结节。本研究的结果表明，该技术的筛查效能满足临床高危人群筛查需求，诊断效能基本达到辅助诊断标准，其非侵入性、低成本、安全的特点为肺癌早期检测提供了新路径，未来可通过算法优化与多中心数据迭代进一步提升其应用价值。

利益冲突：陈巧芬在杭州汇馨传感技术有限公司任职，作者声明该任职关系未对本研究工作产生影响。

作者贡献：何正富提出研究构想与设计，负责数据收集，论文初稿撰写，参与方法学设计与数据分析；陈巧芬承担模型开发与实现，负责 Python 脚本编写与模型调试及数据分析；邬建敏负责统计学分析、结果解读及气体传感器构建；所有作者均对论文进行了重要的学术内容修改，审阅并同意最终稿，确认对研究中的所有环节负有责任。