上交大附属瑞金医院钟一声团队Biomaterials：超氧阴离子响应型线粒体靶向肽-过硫化物供体用于青光眼视网膜神经节细胞保护

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青光眼是全球导致不可逆失明的主要眼病，其核心病理改变为视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）进行性损伤和死亡。除眼压升高外，越来越多研究表明，线粒体功能障碍与氧化应激在青光眼神经损伤中发挥关键作用。高眼压条件下，RGC线粒体内大量生成活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），触发级联反应并激活线粒体凋亡通路，最终导致神经细胞丢失。

硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）作为一种重要的气体信号分子，具有抗氧化、抑制线粒体凋亡及神经保护作用。然而，传统H₂S供体普遍存在释放不可控、作用部位不精准等问题，限制了其在眼科神经保护中的应用。因此，如何构建一种能够在氧化应激微环境中被特异性激活，并精准作用于线粒体的H₂S递送体系，成为亟待解决的科学问题。

2026年2月，上海交通大学医学院附属瑞金医院及上海交通大学药学院团队在《Biomaterials》杂志在线发表题为 “Superoxide-responsive mitochondria-targeting peptide-persulfide donor conjugate for retinal ganglion cells protection in glaucoma” 的研究工作。该研究构建了一种超氧阴离子响应型线粒体靶向肽-过硫化物供体（RPDP-Mito），在体内外青光眼模型中实现了对RGC氧化应激与线粒体凋亡的协同干预，达到具有显著意义的神经保护效果。

本研究设计了一种新型分子体系RPDP-Mito，其结构由三个功能模块构成：

1、线粒体靶向模块（三苯基膦，TPP）
赋予分子在细胞内优先富集于线粒体的能力；

2、超氧阴离子响应型过硫化物供体（SOPD）
在超氧阴离子（O₂·⁻，一种代表性ROS亚型）作用下发生断裂反应，释放过硫化物并进一步生成H₂S；

3、短肽骨架（CFFEE）
提高分子稳定性和生物相容性。

同时，研究人员设计了两种对照分子：
（1）RPDP-Cont：具有超氧阴离子清除能力，但不释放过硫化物/H₂S；
（2）RPDP：具有过硫化物释放能力，但不具备线粒体靶向模块。

上述分子通过固相多肽合成法制备，并经高效液相色谱及质谱确认其纯度和分子量。为评估RPDP-Mito和RPDP对超氧阴离子的响应性，将500 μM的RPDP-Mito和RPDP与超氧阴离子（O₂·⁻）在37 °C下孵育。使用H₂S选择性荧光探针WSP-5在502/525 nm处的荧光强度增量，在12小时内监测H₂S的释放。结果表明，RPDP-Mito 和 RPDP 均表现出可控且持续的 H₂S 释放，约 1 小时达到峰值，并持续释放 12 小时。相比之下，作为对照分子的 RPDP-Cont 未观察到 H₂S 释放。RPDP-Mito 在室温下为白色粉末，可完全溶于 DMSO，形成无色透明溶液，在 4°C 下于 DMSO 中储存至少一个月仍保持理化性质稳定。将药物注射至大鼠眼的玻璃体腔内后，与对照组相比，眼表或眼底未观察到明显变化，表明眼部相容性良好（图1）。

图1 RPDP-Mito的结构设计和理化性质：（A）RPDP-Mito的合成路线。（B）RPDP-Mito的分子结构。（C）RPDP-Mito释放H₂S的反应路线。（D）TPP、RPDP、RPDP-Mito和RPDP-Cont在10 mM PBS溶液中浓度为20 μM时的紫外-可见光谱。（E）RPDP-Mito、RPDP-Cont和RPDP在12小时内释放的H₂S浓度。（F）RPDP-Mito的固体粉末和DMSO溶液。（G）RPDP-Mito溶于DMSO后储存于4℃。（H）对照组和RPDP-Mito玻璃体腔注射组SD大鼠的眼表图像。（I）对照组和RPDP-Mito玻璃体腔注射组SD大鼠的眼底图像。

使用CCK-8、EdU和活/死细胞检测法对RPDP-Mito在R28细胞上的生物相容性和生物安全性进行了评估。体内评估方面，将RPDP-Mito玻璃体腔注射到Sprague-Dawley (SD)大鼠体内。注射后一周监测眼压(IOP)，并分析角膜、前房角（小梁网）和视网膜组织。结果表明，在测试浓度下，RPDP-Mito未表现出对细胞或组织的毒性（图2）。

体外实验表明，RPDP-Mito可在超氧阴离子存在时发生特异性反应，释放过硫化物并进一步生成H₂S，实现ROS触发型释放机制。荧光共定位实验显示，RPDP-Mito在细胞内与线粒体荧光探针高度重叠，而不含TPP模块的RPDP则呈弥散分布，证实该体系具备明确的线粒体靶向能力。上述结果表明，RPDP-Mito在分子层面实现了： 线粒体定位、超氧阴离子触发、H₂S原位释放，三重功能的有机统一（图2）。

图2 RPDP-Mito 的生物安全性、超氧化物反应性和线粒体靶向递送。(A) CCK-8 检测评估不同 RPDP-Mito 浓度下 R28 细胞的活力。(B) 活/死细胞检测证实 RPDP-Mito 对 R28 细胞无细胞毒性。(C, D) EdU 检测和定量分析表明 RPDP-Mito 不会显著抑制 R28 细胞增殖。(E) 玻璃体内注射 DMSO 或 RPDP-Mito 的大鼠的眼压监测。(F-H) 荧光金逆行标记后视网膜冷冻切片的共聚焦显微镜观察，评估视网膜层厚度和 RGC 计数，表明玻璃体内注射 RPDP-Mito 不会损害视网膜结构或 RGC 存活。GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层； OPL：外丛状层；ONL：外核层。(I, J) 角膜 (I) 和小梁网 (J) 切片的 TUNEL 染色显示，RPDP-Mito 注射后细胞凋亡未增加。(K) 用 BSO 和 RPDP-Cont、RPDP 或 RPDP-Mito 处理的 R28 细胞中线粒体和 H₂S 的免疫荧光染色显示，RPDP-Mito 可响应超氧化物并靶向线粒体释放 H₂S。(L) 用 BSO 和各种 H₂S 供体处理 R28 细胞后线粒体和 H₂S 的免疫荧光染色显示，RPDP-Mito 具有超氧化物响应性和线粒体靶向能力。

在体外实验中，研究人员采用BSO诱导视网膜神经细胞氧化应激损伤模型，系统评估RPDP-Mito的抗氧化能力。结果显示：RPDP-Mito可显著降低细胞内ROS与H₂O₂水平，并恢复谷胱甘肽（GSH）含量，提高细胞总体抗氧化能力（T-AOC）。相比传统H₂S供体NaHS及缓释型供体GYY4137，RPDP-Mito表现出更为显著的ROS清除效果（图3）。进一步研究发现，RPDP-Mito能够上调Bcl-2，抑制Bax表达和细胞色素c释放，并下调Caspase-3、Caspase-9等凋亡相关蛋白表达，从而有效阻断氧化应激诱导的线粒体凋亡通路（图4）。

图3 RPDP-Mito的抗氧化能力。(A) 用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞，并进行ROS免疫荧光染色。(B-D) 用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞，并定量分析H₂O₂水平、GSH水平和T-AOC水平。(E-H) 用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137治疗2周眼高压大鼠视网膜，并检测视网膜中ROS、H2O2、GSH和T-AOC 的水平。

图4 RPDP-Mito对R28细胞线粒体凋亡的影响。(A) 用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞，并进行TUNEL免疫荧光染色。(B) 用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞，并进行线粒体凋亡标志物（包括Bcl-2、Bax和细胞色素C）的Western blot分析。(C) 对用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞，并进行Bcl-2、Bax和细胞色素C表达的Western blot定量分析。 （D、F）用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞后，检测caspase-3/7和caspase-9的免疫荧光激活情况。（E、G）用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞后，定量分析caspase-3/7和caspase-9的激活情况。（H）用RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理BSO预处理的R28细胞后，观察线粒体形态的电镜图像。

在慢性高眼压（COH）大鼠模型中，研究人员通过玻璃体腔注射RPDP-Mito进行干预。结果显示：RPDP-Mito显著降低视网膜ROS水平，恢复GSH含量及抗氧化能力，并明显减少RGC凋亡。在功能学检测方面，闪光视觉诱发电位（F-VEP）结果表明，RPDP-Mito可显著改善P1波潜伏期与振幅，提示其在保护神经结构的同时维持视功能。 (图5，图6)。

图5 RPDP-Mito对眼高压大鼠模型中视网膜神经节细胞线粒体凋亡的影响。(A) 对接受为期2周的慢性眼高压(COH)模型的大鼠进行眼压监测，并分别进行玻璃体内注射RPDP-Mito、NaHS或GYY4137治疗。药物在COH诱导前3天给药，之后每周一次，每次注射量为每眼2 μL。(B) 对玻璃体内注射RPDP-Mito、NaHS或GYY4137后的COH大鼠视网膜切片进行TUNEL免疫荧光染色。(C) 对玻璃体内注射RPDP-Mito、NaHS或GYY4137后的COH大鼠视网膜平铺标本中Brn3a和TUNEL阳性细胞的共定位。 (D) 采用蛋白质印迹法分析经RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理的COH大鼠视网膜中线粒体凋亡标志物（包括Bcl-2、Bax和细胞色素C）的表达。(E) 对经RPDP-Mito、NaHS或GYY4137处理的COH大鼠视网膜中Bcl-2、Bax和细胞色素C的表达进行蛋白质印迹定量分析。(F) 采用电镜观察玻璃体内注射RPDP-Mito、NaHS或GYY4137后COH大鼠视网膜线粒体形态。

图6 RPDP-Mito对COH大鼠视神经的保护作用。(A) 各实验组大鼠眼压变化：假手术+DMSO组（平均眼压：10.52 ± 2.20 mmHg），假手术+RPDP-Mito组（平均眼压：10.17 ± 2.01 mmHg），COH+DMSO组（平均眼压：35.16 ± 3.20 mmHg），COH+RPDP-Mito组（平均眼压：34.90 ± 2.99 mmHg）。在诱导COH前3天进行玻璃体腔给药，之后每周重复一次，每次注射量为每眼2 μL。(B, C) 对接受DMSO或RPDP-Mito治疗2周的COH大鼠，进行荧光金染色并定量分析不同视网膜区域的RGC。 (D) 经2周COH处理并分别用DMSO或RPDP-Mito治疗的大鼠的代表性F-VEP波形。(E, F) 经2周COH处理并分别用DMSO或RPDP-Mito治疗的大鼠的F-VEP记录中P1波潜伏期和振幅的定量分析。误差线表示平均值±标准差 (n = 6)。(G) RGC密度与P1潜伏期之间的Pearson相关性(R² = 0.91，P < 0.0001)。(H) RGC密度与P1振幅之间的Pearson相关性(R² = 0.79，P < 0.0001)。实线代表线性回归拟合，阴影区域表示95%置信区间。

综合体内外实验结果，RPDP-Mito发挥青光眼神经保护作用主要依赖以下机制（图7）：

（1）通过TPP模块实现线粒体靶向富集；
（2）在超氧阴离子刺激下释放过硫化物/H₂S；
（3）清除ROS并恢复线粒体氧化还原稳态；
（4）抑制线粒体依赖性凋亡信号通路；
（5）最终维持RGC存活及视功能稳定。

图7 RPDP-Mito发挥神经保护作用的机制示意图。RPDP-Mito的设计是将基于三苯基膦（TPP）的线粒体靶向基团与超氧化物响应型过硫化物供体（SOPD）偶联，从而实现亚细胞水平的过硫化物/H₂S释放。这种创新设计确保了其对活性氧（ROS），特别是超氧化物离子的选择性激活，从而实现H₂S向线粒体的精准递送。RPDP-Mito被应用于BSO诱导的R28细胞氧化应激模型，并通过玻璃体腔注射给药于COH大鼠模型，以评估其治疗潜力。结果表明，RPDP-Mito能够有效响应ROS，并以线粒体靶向的方式释放H₂S。该机制通过氧化还原调节减轻线粒体凋亡，保持线粒体功能，最终保护RGC免受青光眼损伤。

【文章结论与讨论，启发与展望】

本研究构建了一种新型超氧阴离子响应型线粒体靶向肽-过硫化物供体（RPDP-Mito），在氧化应激微环境中实现了H₂S的精准释放，并在青光眼模型中显著保护视网膜神经节细胞。该策略在分子层面实现了：靶向性、响应性、治疗功能的协同统一，为青光眼等氧化应激相关神经退行性疾病提供了新的干预思路，也为刺激响应型气体信号分子递送体系的构建提供了重要参考。

上海交通大学医学院附属瑞金医院钟一声教授、黄守约医师、沈玺教授，上海交通大学药学院王寅副教授为该论文的通讯作者，余欢博士后、张严文博士研究生和钟慧敏住院医师为本论文的共同第一作者。本研究受到国家自然科学基金、上海市自然科学基金项目、中国博士后面上项目资助。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961226000785