低剂量放射治疗可通过激活NLRP3炎性小体促进放射性肺炎

原文出处
Li X, Gong Y, Li D, et al. Low-Dose Radiation Therapy Promotes Radiation Pneumonitis by Activating NLRP3 Inflammasome. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2020 ; 107(4): 804-814.

研究背景

肺癌是世界范围内最大的健康挑战，在男性和女性中发病率和死亡率均居第二位。放射治疗在肺癌的治疗中起着重要的作用。放射性肺炎（RP）是接受肺部放射治疗患者最常见的临床毒副作用之一。根据NCCN指南，常规放疗肺部的正常组织剂量-体积限制为：V20 ≤35%，V5 ≤65%，肺平均受照剂量（MLD）≤20 Gy。在临床实践中，放疗科医生在做治疗计划时要考虑这些因素。临床研究表明，低剂量辐射，如V5和V10，是影响RP发生率和严重程度的重要因素，对肺部接受5 Gy和10 Gy的区域进行剂量优化可减少RP的风险。在小鼠辐射损伤模型中，4 Gy和8 Gy照射均可增加弥漫性肺泡损伤，增大肺泡壁厚度。但其中的分子机制尚不清楚。

RP的特点之一是细胞因子的激活和释放。IL-1是最有效的早期细胞因子之一，可诱导其他细胞因子的产生。Caspase-1介导的IL-1蛋白表达受NLRP3的调控。NLRP3炎性小体在多种炎性疾病的发生和发展中起着重要作用。近年来，NLRP3炎性小体也被报道在哮喘、特发性肺病和辐射引起的肺部炎症中发挥重要作用。本研究的目的是研究NLRP3炎性小体在体内外低剂量照射后发挥的作用。此外，本研究旨在探索NLRP3激活以及NLRP3抑制剂在体内实验治疗效果的可能机制，并确定NLRP3炎性小体的抑制或缺失是否对RP的保护起至关重要的作用。

研究结果

结果一、NLRP3炎性小体在低剂量辐射条件下被激活
研究人员对培养的THP-1细胞（人单核细胞系）和分化的THP-1细胞进行不同剂量的辐照处理，以确定低剂量的辐射是否可以在体外激活NLRP3炎性小体。Western blot结果显示，2 Gy照射增加了NLRP3和裂解型Caspase-1在蛋白水平的表达（图1A）。研究者通过ELISA法检测THP-1细胞上清液，发现2 Gy照射后细胞分泌IL-1和IL-18水平升高。然而，这些细胞因子的表达水平与辐射剂量的增加无关（图1B、1C）。

结果二、THP-1细胞经辐射后产生的ROS可激活NLRP3炎症小体
ROS的产生在辐射引起的肺损伤中发挥重要作用，也是参与NLRP3炎症小体激活的途径之一。研究人员通过流式细胞术检测了2 Gy照射和LPS干预后细胞内ROS的产生情况。将未处理的细胞作为阴性对照，平均荧光团强度（MFI）分析显示，在照射后的1h、4h和6h时，照射组的ROS生成较对照组增加，在照射后1h，照射组和LPS干预组的ROS产生没有差异（图2A）。图2B显示，在照射后4h，照射组和LPS干预组的ROS生成均较对照组有所增加（图2B）。

随后，研究人员使用不同浓度的NAC（一种ROS的抑制剂），来研究低剂量辐照对细胞内NLRP3炎性小体激活的抑制作用。与对照组细胞上清相比，加入ROS抑制剂的THP-1细胞上清中的IL-18和IL-1蛋白含量明显降低。（图2C、2D）。综上所述，这些结果表明，低剂量辐射诱导的炎性小体激活需要ROS的参与。

结果三、低剂量和高剂量辐射可引起小鼠肺内NLRP3的激活
为了检测NLRP3炎症小体在体内的激活情况，野生型雄性C57BL/6小鼠接受2 -16 Gy不同剂量的胸部放射治疗。小鼠肺组织免疫荧光染色显示，NLRP3在2 Gy的剂量下被激活，且激活程度与辐射剂量无关（图3C、3D）。此外，NLRP3炎症小体的激活主要出现在气道，而非肺实质（图3A、3B）。
研究人员在不同的时间点收取了受照射的小鼠肺组织，以研究NLRP3在体内的激活是短暂的还是持续的。结果显示，NLRP3炎性小体在照射后1周表达明显，并在8周时仍保持激活状态（图3）。此外，NLRP3的表达水平不随时间发生变化（图3C、3D）。

结果四、NLRP3促进 LPS介导的小鼠肺组织单核细胞浸润
为了检测低剂量辐射对NLRP3基因敲除小鼠的影响，并评估NLRP3的激活是否会增强肺的超敏反应，NLRP3基因敲除小鼠和野生型小鼠分别接受2 Gy剂量的胸部辐射，然后经鼻给予LPS或PBS。未辐照的NLRP3基因敲除小鼠和野生型小鼠分别用LPS或PBS作为对照。图4A显示了各组肺组织H&E染色的代表性图像。炎症细胞聚集到肺部与辐射诱发的肺炎有关。在NLRP3基因敲除小鼠和野生型小鼠中，放疗和LPS均诱导免疫细胞浸润并增加肺泡壁厚度（图4A b-c f-g）。在NLRP3基因敲除小鼠和野生型小鼠中，照射后再给予LPS会加重炎症反应（图4A d、h）。

为了确定相关的免疫细胞亚型，我们测量了NLRP3基因敲除小鼠和野生型小鼠支气管肺泡灌洗液细胞的浸润情况。在照射组中，LPS在野生型或NLRP3基因敲除小鼠中均未增加中性粒细胞、淋巴细胞和白细胞浸润（图4B、4D和4E）。然而，照射后给予LPS处理，野生型小鼠单核细胞数量增加，而NLRP3基因敲除小鼠没有增加（图4C）。这些结果表明，在这一过程中，单核细胞是改变最多的细胞亚型，而在野生型小鼠中，NLRP3炎性小体的激活可能会引起单核细胞浸润。

图4 NLRP3促进 LPS介导的小鼠肺组织单核细胞浸润

结果五、NLRP3抑制剂MCC950可改善胸部辐射损伤小鼠模型的RP情况
MCC950是一种有效的、选择性的NLRP3小分子抑制剂，可阻断典型和非典型NLRP3的激活。MCC950特异性抑制NLRP3，减少IL-1的生成，在小鼠和人类细胞中均具有活性。研究者对2 Gy和16 Gy实验组以及未照射对照组小鼠的肺组织进行H&E染色（图5A-C），炎症评分结果显示，5mg /kg和10mg /kg MCC950处理降低了2 Gy和16 Gy照射组的炎症评分，尽管16 Gy组的降低没有统计学意义（图5D、5E）。

研究人员进一步检测了2 Gy和16 Gy照射的NLRP3基因敲除小鼠和野生型小鼠以及5mg/kg和10mg/kg MCC950处理组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子的水平。在2 Gy照射组中，MCC950治疗降低了IL-6的分泌，但没有降低TNF-α、IL-1β或IL-18的分泌。在16 Gy照射组中，MCC950处理降低了IL-6、IL-18和IL-1β的分泌，但TNF-α的分泌没有降低。这些结果表明，无论是低剂量照射还是高剂量照射，NLRP3抑制剂MCC950都能在一定程度上改善细胞因子的产生（图6）。

图6 NLRP3抑制剂MCC950都能在一定程度上改善细胞因子的产生

研究结论
1、NLRP3炎性小体在接受体内及体外低剂量照射后均可被激活，低剂量放射治疗可通过激活NLRP3炎性小体促进放射性肺炎；
2、NLRP3的抑制或缺失可特异性缓解辐射和LPS诱导的小鼠肺部炎症；
3、本研究揭示了低剂量放射治疗引起放射性肺炎的相关机制，并为放射性肺炎患者提供了一种潜在的治疗策略。

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