Nat Biotechnol：CRISPR单碱基编辑准确！
2017-04-14 张迪 生物通
来自韩国基础科学研究所IBS的研究人员发表了题为“Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases”的文章，证实了最近研发的基因编辑方法的准确性。这一研究成果公布在4月10日的Nature Biotechnology杂志上。
来自韩国基础科学研究所IBS的研究人员发表了题为“Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases”的文章，证实了最近研发的基因编辑方法的准确性。这一研究成果公布在4月10日的Nature Biotechnology杂志上。
文章的通讯作者是基因编辑领域的大牛KIM Jin-Soo，其研究组曾在Nature等顶级杂志发表多篇文章，提出了CRISPR技术领域的不少创新想法，比如他们曾设计出了目前最小的CRISPR-Cas9，并通过腺伴随病毒(AAV)将其递送到了肌细胞和小鼠的眼睛里，用以编辑导致失明的基因。
对于最新这项研究，Kim表示，“这是第一次在整个基因组水平上验证了这种碱基编辑的准确性”。
基因编辑工具的快速发展令整个生物学研究领域疯狂，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，这是一种比其前身更快更便宜的工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1通过切除小的DNA序列，讷讷感沉默或降低错误基因的表达。然而，去年一种新的碱基编辑方法：不会引起随机的DNA缺失和插入，而是替换一个DNA基因，吸引了生物学家的注意。
这种基因校正方法很关键，因为一些疾病就是因为DNA的四种基本组分之一（腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T））出错引起的。DNA中的单核苷酸错误被称为点突变，由点突变引起的疾病包括：囊性纤维化，镰状细胞性贫血和色盲。
与现有的第三代DNA剪刀不同，单碱基编辑方法是由与CRISPR-Cas9（nCas9，切口酶）变体与另外一种称为胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase）构成，用T代替C，通过导向RNA直接指向正确DNA位置。不过到目前为止，还不知道这种碱基编辑器是仅在错误基因区域中发挥作用，还是能在其它区域进行替换（脱靶）。
上个月，IBS的研究人员分别改变了肌营养不良蛋白基因（Dmd），以及酪氨酸酶基因（Tyr）中的单个核苷酸，用以检验CRISPR-nCas9胞苷脱氨酶的融合。研究获得了两方面的成功：携带Dmd基因单个核苷酸突变的小鼠胚胎，导致小鼠肌肉中无法产生dystrophin蛋白；另外一种是携带Tyr突变的小鼠，显示的病症是白化病性状。Dystrophin蛋白与肌肉肌营养不良症疾病相关，酪氨酸酶控制黑素的生成。
而在最新这项研究中，他们又在基因组范围能验证了这一方法的准确性，并在肌营养不良蛋白和酪氨酸酶基因中修改了单个核苷酸。
为了确定整个基因组的基因编辑正确性，研究人员修改了一种错误检测技术：Digenome-seq，这一技术可在全基因组范围内检测人类细胞中的CRISPR/Cas9脱靶效应（新方法终结CRISPR-CAS9争论）。同时也改进了计算机程序（Digenome 2.0），更全面地识别脱靶，比较了不同的导向RNA，从而找到了减少故障并增加特异性的RNA。
利用这种技术，研究人员验证了碱基编辑器技术的正确性，并且发现它比当前第三代CRISPR-Cas9更准确。碱基编辑技术能诱导人类基因组中1-67个位点发生C-to-T转换，而CRISPR-Cas9在30-241个位点能进行切割，这意味着碱基编辑器正在减少脱靶变化。 “因此，预计这些碱基编辑器将会成为广泛使用的受欢迎CRISPR技术，”Kim说。
原始出处：
Kim D， Lim K， Kim ST， et al.Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.Nat Biotechnol. 2017 Apr 10.
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