酒精通过中性粒细胞胞外陷阱激活肝星状细胞和单核细胞，加速MASLD相关肝纤维化

【导语】

酒精性肝病（ALD）和代谢相关脂肪性肝病（MASLD）是全球慢性肝病的主要病因。随着肥胖等代谢综合征的流行，饮酒和代谢的共存产生一种新的疾病亚型——MetALD。大量研究表明，饮酒可增加MASLD患者肝纤维化和肝癌发生风险。然而，酒精加速MASLD疾病进展的机制尚未完全阐明。

酒精摄入会导致肝细胞受损和kuffer细胞活化，进而分泌炎性趋化因子，招募中性粒细胞至损伤部位。中性粒细胞释放的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）进一步加剧肝脏损伤和炎症反应。

“脂肪肝学苑”第33期，特别推荐发表于gut的一项研究“Neutrophil Extracellular Traps activate hepatic stellate cells and monocytes via NLRP3 sensing in alcohol-induced acceleration of MASH fibrosis”，该研究解析酒精如何通过激活NETs和NLRP3炎症小体，加速MASH患者的肝纤维化进程。

全文地址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38777573/

· 结果 ·

1. 酗酒增加MASLD/MASH小鼠的肝损伤和纤维化

9-10周龄C57BL/6小鼠根据是否接受MASH饮食和是否饮酒被分为四组（图1A）。研究结果表明，MASH饮食组体重最重，MASH+酒精组次之（图1B-C）。MASH饮食与酒精的联合作用加剧了单纯MASH饮食所致的肝损伤及肝脏脂肪变性（图1D-K）。综上所述，MASH饮食联合酒精可加重单纯MASH饮食所致的肝损伤、脂质沉积。

图1

2. 转录组学分析显示联合肝损伤信号通路存在差异表达

在nCounter纤维化面板上评估肝脏mRNA的表达，热图显示MASH+酒精组与仅MASH组或仅酒精组之间的差异表达基因（DEGs）存在明显分离（图2A）。约11%的DEGs是MASH+酒精组独有的（图2B）。火山图显示，MASH+酒精组中有大量上调的基因（图2C）。通过GO分析和对DEGs的功能分析，发现与细胞外基质重塑和炎症相关的通路在MASH+酒精组中显著上调，其中包括与中性粒细胞及其活化相关的基因（图2D）。综上所述，酒精通过调节与中性粒细胞相关的信号通路促进MASH的疾病病理发生。

图2

3. MASH加饮酒更加促进肝脏中性粒细胞浸润和中性粒细胞细胞外陷阱的形成

与单纯饮酒组或单纯MASH组相比，MASH+酒精组小鼠肝脏中的Ly6G阳性细胞显著增加，趋化因子（CXCL1）和脂质运载蛋白2 (LCN2)水平也显著升高（图3A-E）。通过ELISA和免疫荧光检测中性粒细胞NETs标志物，结果显示酒精促进了NETs的形成（图3F-J）。进一步分析发现，在ALD患者中，BMI≥25的患者肝脏中CXCL1、LCN2、NE的表达水平高于BMI≤25或无饮酒史的MASH患者（图3K-M）。综上所述，酒精滥用可能诱导中性粒细胞浸润和NETs形成增加，从而加剧肝脏损伤。

图3

4. NETs通过NLRP3信号直接激活肝星状细胞

从人血液中分离中性粒细胞使用酒精或棕榈酸诱导NETs形成后，除去上清液中的中性粒细胞，将无细胞网与LX2细胞共培养24小时（图4A）。结果显示α-SMA和COL1A1的表达以及IL-1β的释放增加，在与LX2细胞共培养前用脱氧核糖核酸酶I (DNase)处理NETs后，NETs对HSCs的激活作用减弱（图4B-D）。与未处理的细胞相比，用NLRP3炎症体抑制剂MCC950处理LX2细胞后，α-SMA产生和IL-1β释放显著减少（图4E-F）。WT小鼠中分离出的HSC与酒精或PA诱导的NETs共培养，显示α-SMA表达和IL-1β释放增加,而分离自NLRP3-KO小鼠的HSC没有显示出这样的趋势（图4G-H）。

图4

5. NETs通过NLRP3诱导单核细胞产生促炎细胞因子

NETs与人单核细胞(THP1)共培养时，IL-1β、肿瘤坏死因子-α (TNFα)和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP1)的产生显著增加。此外，用NETs加LPS双重刺激单核细胞比单独用NETs或脂多糖(LPS)诱导炎症因子增加更为明显。使用MCC950或DNase处理后均能减少NETs诱导的IL-1β产生(图5)。综上所述，NETs通过NLRP3途径激活单核细胞，促进炎症反应。

图5

6. 清除中性粒细胞或DNase治疗可改善酗酒+MASH联合肝损伤的肝损伤和纤维化

为评估中性粒细胞耗竭和NETs破坏在C57BL/6J小鼠中的作用，使用抗Ly6G抗体或脱氧核糖核酸酶，每周两次，同时给予MASH+酒精饮食喂养(图6A)。结果显示，循环中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+)和肝脏损伤在MASH+酒精组明显增加，在抗Ly6G抗体处理组和DNase组中显著减少(图6B-H)。此外，这些治疗还减少了NETs标志物以及LCN2的水平（图6I-O）。抗Ly6G抗体或脱氧核糖核酸酶治疗也显著减弱了用MASH+酒精组的肝纤维化（图6P-Q）。综上所述，耗竭中性粒细胞或破坏NETs可能有助于减轻MASH+酒精饮食引起的肝脏损伤和纤维化。

图6

7. 酗酒显著上调MASH中NLRP3炎性体的激活，在联合肝损伤模型中抑制NLRP3可减轻NETs和肝纤维化

MASH+酒精显著增加了NLRP3和下游的半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)炎症小体组件以及IL-1β的水平(图7A-H)。NLRP3敲除小鼠或使用MCC950抑制NLRP3的野生型小鼠，肝脏损伤和炎症水平减少(图7I-M)。表明NLRP3抑制可以预防由联合肝损伤引起的肝损伤和炎症。同时，NLRP3敲除小鼠或使用MCC950后肝脏中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+)浸润和NET形成减少(图7N-U)，此外，肝脏纤维化程度也明显减轻(图7V-X)。综上所述，NLRP3在参与酒精诱导的中性粒细胞募集和NETs形成，从而在MASH+酒精饮食引起的肝脏损伤和纤维化中起双重作用。

图7

· 研究结论 ·

该研究通过转录组分析和机制研究，发现酒精和MASH饮食结合可通过调控中性粒细胞募集和NETs释放，进而激活肝星状细胞和单核细胞的NLRP3炎症体，从而促进促炎因子产生，加重肝脏损伤和肝纤维化。当NETs被Ly6G中和抗体或DNase处理，或NLRP3被MCC950抑制时，肝脏损伤和肝纤维化明显改善。

该研究揭示了酒精通过诱导肝星状细胞和单核细胞的激活促进肝纤维化，并为利用Ly6G中和抗体、DNase和MCC950来治疗酒精和MASH饮食引起的纤维化提供新的治疗策略。