首次揭示口腔隧道型鳞状细胞癌基因图谱，TP53/CDKN2A低频、FAT1高频，与常规口腔鳞状细胞癌明显不同，为鉴别诊断提供新线索

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摘要

目的：口腔隧道型鳞状细胞癌（CC，oral carcinoma cuniculatum，也译作穿掘性癌）是口腔鳞状细胞癌（OSCC）的罕见亚型，其特征为高分化、掘穴样浸润模式和轻微细胞异型性。由于形态温和，活检时难以与非肿瘤性病变鉴别，诊断具有挑战。即使在手术标本中，CC也常需与常规OSCC鉴别。CC与常规OSCC存在组织学重叠，提示二者可能构成连续疾病谱。为明确纯CC的基因特征，研究者分析23例具有掘穴样浸润模式的OSCC，并将其分为CC、常规OSCC（SCC）和不确定性CC（UCC）3组。

方法：回顾性审查多中心档案中的2002例OSCC，从中筛选23例具有CC特征性掘穴样浸润模式的病例。依据WHO诊断标准分为3个研究组，并回顾临床病理特征。采用靶向NGS识别具有临床意义的基因变异，同时进行免疫组织化学染色。

结果：23例在组织学上分为CC（n=8）、UCC（n=7）和SCC（n=8）。临床上，CC主要发生于牙龈，无复发或转移；SCC主要累及舌，且发生复发和转移。CC中87.5%（7/8）检出基因变异；TP53（12.5%）和CDKN2A（25.0%）变异频率较低，而FAT1（50.0%）、NOTCp（37.5%）、PIK3CA（37.5%）和CASP8（50.0%）变异频率较高。相比之下，SCC中TP53（75.0%）和CDKN2A（75.0%）变异常见，而未检出FAT1和NOTCp变异。与上述结果一致，CC中p53呈野生型染色模式，Ki-67标记指数较低。UCC的临床病理及基因特征介于两者之间。

结论：本研究首次描述口腔CC的基因特征，且不同于常规OSCC。该基因特征可能参与CC的生物学行为，并有望成为鉴别诊断工具。仍需更大队列研究确认CC与常规OSCC的关系，并全面阐明CC的基因图谱。

引言

OSCC是最常见的口腔恶性肿瘤。CC是OSCC极为罕见的亚型，具有高分化、局部破坏性和不转移等特征。“cuniculus”指类似兔穴的地下互联网络，用于描述该肿瘤标志性的浸润模式。Aird等于1954年首次描述足底CC，Flieger和Owinski于1977年报告口腔CC。组织学上，口腔CC由含角化物的隐窝状复层鳞状上皮形成特征性、独特的掘穴样浸润模式，且始终缺乏显著细胞异型性。

由于形态温和且无明显细胞异型性，CC常被漏诊或误诊，尤其在活检标本中，导致多数病例术前诊断不准确。CC常被误诊为反应性增生、角化过度、脓肿和骨髓炎等，从而延误治疗。遗传分析可能有助于CC与上述病变的鉴别。OSCC主要在TP53、CDKN2A、FAT1、NOTCp、PIK3CA和CASP8等基因中存在致病性体细胞改变。某些OSCC特殊亚型具有不同于常规OSCC的遗传特征，提示CC也可能具有独特特征。据作者所知，既往尚无研究识别CC患者的遗传改变。详细分析CC基因谱可能有助于病理诊断并增进对其生物学的认识。

口腔CC研究的一项障碍是即使在手术标本中也难以确诊。CC总体预后极佳，但与常发生复发和转移的常规OSCC鉴别困难，病理医师间判断亦不一致。两者主要根据浸润模式和细胞异型性区分，但部分常规OSCC也呈类似掘穴样浸润，且核多形性等细胞异型性评估常存在观察者差异。这使CC与常规OSCC的界限模糊。因此，有观点认为CC既是独立实体，也可能与常规OSCC构成连续疾病谱。

既往已报道含常规OSCC成分的CC、复发时部分CC转化为常规OSCC、CC以常规OSCC形式复发，以及CC淋巴结转移灶被诊断为常规OSCC的病例。既往部分所谓CC不符合组织学诊断标准，不能视为纯CC，本文将其称为UCC。因此，要明确CC基因谱，有必要从CC至常规OSCC的疾病谱中筛选纯CC。

本研究评估23例具有CC特征性掘穴样浸润模式的OSCC。根据WHO口腔CC组织学诊断标准，将病例分为CC（典型CC）、SCC（常规OSCC）和UCC（组织学上难以与前两者区分的交界性病例）3组，旨在阐明口腔CC及组织学相似OSCC的遗传特征。据作者所知，这是首项提供CC及其他组织学相似疾病遗传数据的研究。

材料与方法

患者筛选与组织学评估

研究者回顾冈山大学医院、东京科学大学医院、大阪大学牙科医院及NHO大阪国立医院病理档案中的2002例OSCC，筛选23例具有掘穴样浸润模式的病例，并排除非原发或复发性OSCC。

切除组织以10%中性缓冲福尔马林固定并石蜡包埋。FFPE组织连续切成4 μm厚切片，进行H&E及免疫组织化学染色。来自不同机构的3名经验丰富的口腔颌面病理医师独立复核23例OSCC。分类依据WHO第5版头颈部肿瘤分类中CC的必要诊断标准：高分化、含角化物的隐窝、不超过轻度异型，以及迷宫样、掘穴样、黏附性浸润模式。此外，还评估理想诊断标准（角化性微脓肿、间质中性粒细胞、微小死骨、黏膜骨膜部位骨侵犯）及肿瘤边缘上皮改变。独立复核后，通过讨论为每例达成最终共识诊断。

3名病理医师一致认为满足全部必要标准者归入CC组；满足部分必要标准但观察者对CC确诊存在分歧者归入UCC组；尽管可能满足部分必要标准，但综合评估后一致认定并非CC者归入SCC组。

免疫组织化学

使用Bond III自动染色仪对石蜡切片进行免疫组织化学染色。主要抗体包括抗p53（克隆Pab1801，Cat# sc-98）和抗Ki-67（克隆MM1，Cat# NCL-L-Ki-67-MM1）。按照既往标准将p53免疫染色模式分为野生型或异常型。

分子分析

按照既往方法，采用SureSelect Cancer CGP Assay进行NGS。DNA肿瘤基因panel用于检测具有临床意义的遗传改变，包括679个基因的SNV和小型插入/缺失（Indel），以及32个基因的拷贝数变异（CNV）。所研究基因见补充表1。2名病理医师识别肿瘤含量>15%的FFPE蜡块，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取基因组DNA。采用定制SureSelect Low-Input Target Enrichment System制备测序文库，并使用Illumina MiSeq测序。Alissa Reporter 1.3.3用于变异检出并计算肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）。排除内含子DNA、非编码DNA、VAF<5%的变异，以及根据gnomAD数据库MAF>0.001的变异。

系统判定检出变异（SNV/Indel）的致病性。首先用ClinVar和InterVar注释，将数据库分类为“致病”或“可能致病”的变异在结果中归为“致病性突变”。未达到上述标准以及ClinVar或InterVar标记为“意义不明确”的变异，进一步使用SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster进行计算机功能预测；若至少一种工具预测有害，则在结果中归为意义不明确变异（VUS）。上述分子分析专为本研究实施，由3名分子病理医师和1名生物信息学专家评估结果解释。

统计分析

数据以均数±标准差表示。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 10进行统计分析和作图。p<0.05视为具有统计学意义，采用Fisher确切检验和Tukey多重比较检验。

结果

病例分类

回顾性研究23例以掘穴样浸润生长为特征的OSCC，依据WHO CC必要诊断标准分为CC和SCC；不能明确归入CC或常规OSCC者暂归UCC。MRI显示3组病变均为内生性生长（图1A、C、E）。CC组具有典型CC全部必要组织学特征，包括含角化物隐窝、不超过轻度异型、迷宫样掘穴样黏附性浸润及高分化（图1B–Bʺ）。UCC组具有数项提示CC的特征，但因观察者意见不一致而归为不确定；争议包括细胞异型程度、迷宫样结构不完整且连续性不清（5/7例），以及隐窝内角化物不足（3/7例）（图1D–Dʺ）。SCC组也符合掘穴样生长等部分必要标准，但由于细胞学异型超过轻度、浸润前缘不黏附等与CC诊断不符的特征，更符合常规OSCC，最终归入SCC（图1F–Fʺ）。3组其他组织学特征见补充图1。

图1A–Fʺ. CC、UCC和SCC组的MRI及组织学表现。A、C、E为术前T2加权MRI，箭头示肿瘤位置；B–Bʺ、D–Dʺ和F–Fʺ分别为CC、UCC和SCC的H&E图像，B/D/F为低倍，B′/D′/F′为中倍，Bʺ/Dʺ/Fʺ为高倍。UCC具有数项提示CC的特征，但迷宫样结构不完整且隐窝内角化物不足；SCC呈掘穴样浸润并有超过轻度的明显细胞异型。比例尺：B、D、F=2500 μm；B′、D′、F′=1000 μm；Bʺ、Dʺ、Fʺ=100 μm。

23例中有1例因迷宫样结构不完整和隐窝内角化物不足最初考虑归入UCC（图2A–C）；但该病例还存在明显细胞异型的常规OSCC成分及异常p53免疫染色模式，最终归入SCC组（图2C、D）。

图2A–D. UCC和SCC成分共存病例的组织病理表现。A–C为代表性H&E图像：A低倍、B中倍、C高倍；左侧UCC成分呈不完整迷宫样结构及隐窝内角化物不足，右侧SCC成分呈明显细胞异型和常规浸润特征。B、C分别为A、B中黑色虚线框的高倍图。D为对应B图边界处p53免疫染色，SCC区域呈异常p53染色。比例尺：A=2500 μm；B、D=1000 μm；C=200 μm。

临床验证

为验证CC组特征符合已知CC临床谱且区别于其他组，比较3组临床特征（表1）。23例中位年龄74岁（范围44–88岁），男性15例（65.2%），女性8例（34.8%）。CC、UCC和SCC组中位年龄分别为71、78和74岁。最常见原发部位为牙龈（11/23，47.8%），其次为舌（8/23，34.8%）。CC和UCC主要位于牙龈［分别6/8（75.0%）和4/7（57.1%）］，SCC最常见于舌［4/8（50.0%）］。

全队列早期T1–T2为9例（39.1%），晚期T3–T4为14例（60.9%）。CC组晚期T分期最多［7/8（87.5%）］，其次为SCC组［5/8（62.5%）］；UCC组更常见早期［5/7（71.4%）］。淋巴结转移阴性20例（87.0%），阳性3例（13.0%）；阳性病例均在SCC组［3/8（37.5%）］。2例（8.7%）出现复发或术后远处转移，均在SCC组［2/8（25.0%）］；CC和UCC均无复发或转移。CC组年龄、性别、部位及无转移等临床特征与既往研究一致，提示基于组织学对掘穴样浸润OSCC进行分类可有效区分纯CC与常规OSCC；UCC可能是临床特征介于CC和SCC之间的实体。

表1. 具有掘穴样浸润模式的口腔鳞状细胞癌临床特征。CC：隧道型鳞状细胞癌；SCC：鳞状细胞癌；UCC：不确定性隧道型鳞状细胞癌。

分子遗传学分析

CC、UCC和SCC组中，包括致病性突变（SNV/Indel）及CNV（获得/缺失）在内的遗传改变检出率分别为75.0%（6/8）、100%（7/7）和100%（8/8）（图3A、B）。全组最常改变的基因为CDKN2A（12/23）、TP53（7/23）和PIK3CA（6/23）。CC与SCC组的致病性突变（p=0.10）或CNV（p=0.066）频率无统计学显著差异。3组TMB均较低且无显著差异；MSI评分同样较低，全部病例均为微卫星稳定。致病性突变和CNV详情见补充图2。

聚焦OSCC发病关键基因后，CC组87.5%（7/8）检出包括致病性/VUS突变及CNV在内的遗传改变（图3D）。CC中仅少数患者检出OSCC两大主要致病基因TP53和CDKN2A；相反，约半数CC检出PIK3CA（PI3K通路）、CASP8（细胞死亡）、FAT1和NOTCp（细胞分化）突变。这提示CC可能具有不同于常规OSCC的基因谱，CC遗传分析可能有助于鉴别诊断，尤其是与非肿瘤性上皮病变鉴别。

图3A–E. CC、UCC和SCC组基因谱。（A）至少存在1个致病性SNV/Indel的病例比例；（B）3组CNV病例比例；A、B柱状图上p值为CC与SCC比较（Fisher确切检验）。（C）3组TMB和MSI分布，每点代表1例（Tukey多重比较）。（D）聚焦口腔SCC发病关键基因的CC组遗传改变汇总。（E）各关键基因改变比例；堆叠柱示各组任何改变病例数，饼图示各组改变比例。VUS为计算机工具预测有害的意义不明确变异。

TP53突变在SCC中显著多于CC［6/8（75.0%）与1/8（12.5%），p=0.020］。CDKN2A改变（致病性/VUS突变或CNV缺失）也呈SCC高于CC的趋势［6/8（75.0%）与2/8（25.0%），p=0.066］。相反，全部归为VUS的FAT1突变在CC［4/8（50.0%）］和UCC［2/7（28.6%）］中显著更常见，在SCC中完全缺失［0/8（0.0%）；CC与SCC比较p=0.038］。CC中的FAT1突变均为终止获得突变，UCC中则为非同义突变。NOTCp亦仅见于CC［3/8（37.5%）］和UCC［2/7（28.6%）］。PIK3CA和CASP8改变见于3组，CC与SCC间无显著差异。

综合结果显示CC与SCC基因谱不同：SCC以TP53和CDKN2A等抑癌基因改变高频为特征，CC则存在SCC中缺失的FAT1和NOTCp改变；UCC遗传特征介于两者之间。

免疫组织化学结果

TP53和CDKN2A均为OSCC主要抑癌基因，CDKN2A参与细胞周期调控。研究者推测这些改变可能参与3组表型和生物学行为，因此进行p53和Ki-67免疫组织化学。CC和UCC中p53呈野生型染色，SCC中呈异常染色（图4A）。CC野生型模式与SCC显著不同（p=0.0007），与遗传分析一致。Ki-67标记指数在CC、UCC和SCC中分别为18.8±5.2%、21.4±12.0%和32.9±11.2%；CC增殖率显著低于SCC（p=0.037）。

图4A–D. CC、UCC和SCC组p53及Ki-67免疫组织化学特征。（A）3组p53染色代表图；（B）3组p53染色模式比例，p值为CC与SCC比较（Fisher确切检验）；（C）3组Ki-67染色代表图；（D）3组Ki-67标记指数分布，每点代表1例，p值为3组比较（Tukey多重比较）。

讨论

本研究首次对临床和组织学确诊的口腔CC进行遗传分析，几乎全部CC均检出遗传改变。CC以OSCC两大驱动基因TP53和CDKN2A突变频率较低，而FAT1、NOTCp等其他关键基因改变频率较高为特征。因此，CC基因谱可能不同于常规OSCC，其遗传分析有望用于鉴别诊断，尤其是鉴别非肿瘤性病变。

口腔CC组织学表现为高分化和掘穴样浸润，临床预后极佳，复发罕见且不发生转移。典型特征包括60–70岁发病、男性略多、最常见于牙龈而后为舌。本研究CC组平均年龄约70岁，男性略多，最常见部位为牙龈，其次为舌，且无淋巴结转移或复发，支持本组为纯口腔CC。

CC组TP53、CDKN2A（SNV/Indel；CNV）、FAT1、NOTCp、PIK3CA和CASP8改变频率分别为12.5%、25%/0.0%、50.0%、37.5%、37.5%和50.0%。一般OSCC队列相应频率为TP53 61.7%–70.4%；CDKN2A SNV/Indel 12.8%–26.0%、CNV 14.9%–74.0%；FAT1 9.1%–30.0%；NOTCp 3.2%–25.5%；PIK3CA 10.6%–16.8%；CASP8 10.0%–13.9%。因此CC的TP53突变和CDKN2A CNV更少，而FAT1、NOTCp、PIK3CA和CASP8更高。疣状癌是外生性生长、高分化的罕见OSCC亚型，缺乏TP53、CDKN2A、FAT1和NOTCp改变，也支持CC具有独特基因谱。仍需研究这些基因突变是否参与CC特异性生物学。

CC组75.0%（6/8）同时存在FAT1、NOTCp、PIK3CA和CASP8四个基因中的多个突变，提示检测这些改变可能有助于在活检样本中鉴别CC与非肿瘤性上皮病变。PIK3CA高频突变还具有临床意义，因为其是治疗靶点；已有抗肿瘤活性的PI3K抑制剂可能扩展这一OSCC特殊亚型的潜在治疗选择。

本研究检出的全部FAT1突变经数据库注释和计算机预测均归为VUS。生理状态下，FAT1调控与细胞黏附和极性相关的肌动蛋白动力学，参与发育和器官形成，并调节线粒体功能。但FAT1 mRNA及蛋白体积巨大，其生物学功能仍难阐明。FAT1虽是人类癌症中最常突变的基因之一，但无明确突变热点，单个变异的功能后果往往不清，因此ClinVar中多数FAT1变异归为“意义不明确”。FAT1突变被认为参与OSCC起始与进展，但其对CC的作用仍需研究。

TP53在DNA损伤反应中激活，在多数常见人类恶性肿瘤中突变；CDKN2A参与细胞周期调控。二者常共同突变，并与较低OS及治疗耐药等不良预后相关。与遗传结果一致，CC呈p53野生型染色和低Ki-67标记指数。既往少数CC病例同时报告p53野生型及异常型染色，但未以遗传分析确认。既往CC的低Ki-67标记指数（<5%–15%）与本研究相符。CC的p53野生型和低Ki-67可能使活检时更难与非肿瘤性上皮病变区分；SCC则呈p53异常染色和高Ki-67。因此，p53染色模式和Ki-67指数可能是CC与组织学相似OSCC鉴别的辅助工具。考虑到OSCC多灶性，既往CC以常规OSCC转移或复发的病例，可能存在共存SCC成分，或本身具有向SCC表型进展的潜能。

CC与常规OSCC的组织学边界常模糊。本研究将难以归入CC或常规OSCC者归为UCC，结果显示UCC的临床、病理和遗传特征均介于CC与SCC之间。这带来两种可能：第一，UCC并非独立生物学实体，而是CC和SCC的异质性混合；该名称源于3名病理医师使用WHO标准后仍不能达成诊断共识，加入额外分子标志物的其他分类方法可能将这些病例归入CC或SCC。第二，具有掘穴样浸润的OSCC可能形成从CC至SCC的连续生物学谱，UCC为中间阶段。本研究1例在组织学上共存UCC和SCC，部分支持该观点；既往亦有含SCC成分的CC报告。

尚不清楚组织学特征是否随时间由CC变为SCC，或遗传改变累积是否引发侵袭性转化。例如，鼻腔内翻性乳头状瘤在初始KRAS或EGFR突变基础上获得TP53或CDKN2A突变，可驱动侵袭性转化。CC经UCC样状态进展至SCC可能也涉及遗传改变序贯累积，但仍需验证。

UCC解释需谨慎。为明确纯CC遗传特征，本研究暂将部分OSCC归为UCC，但这一诊断模糊类别对研究者和临床病理医师均具挑战。尽管部分病理医师诊断为CC，团队仍未能一致分类。UCC虽呈中间特征，但无TP53突变、Ki-67较低且无转移或复发，提示其可能更接近CC。研究和诊断时，CC/SCC二分类优于本研究三分类；p53染色模式和Ki-67指数可能有助于将UCC归为CC或常规OSCC。

局限性

第一，本研究有意聚焦具有CC特征性掘穴样浸润模式的OSCC，这一必要筛选标准可能引入偏倚。因此SCC对照组不能完全代表常规OSCC，观察到的差异应理解为CC与组织学相似OSCC亚群之间的比较，而非CC与所有OSCC的比较。不过，这种靶向方法不太可能扭曲CC内在临床病理和遗传特征。第二，由于CC极为罕见，样本量小不可避免地限制统计效能。因此，尤其是CC遗传图谱及其对肿瘤生物学影响的发现，需要在更大的多中心队列中验证。

结论

本研究首次全面描述口腔CC的遗传特征。纯CC具有不同于常规OSCC的基因谱，其特征为TP53和CDKN2A改变频率较低，同时其他关键基因突变频率较高。该遗传特征可能参与CC独特的生物学行为，并为鉴别诊断提供潜在工具，尤其是与非肿瘤性病变鉴别。尽管结果提示CC与常规OSCC可能构成连续疾病谱，仍需更大队列研究确认二者关系并全面阐明CC遗传图谱。

文献来源

Ono S, Fukawa Y, Hirose K, et al. Genetic Landscape of Oral Carcinoma Cuniculatum and its Histological Mimics. Head and Neck Pathology. 2026;20:48. doi:10.1007/s12105-026-01921-3.