南开大学/中国医学科学院Biomaterials：序贯靶向型纳米分子伴侣通过打破线粒体功能障碍的正反馈循环用于阿尔茨海默病治疗

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阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，以记忆、认知与行为功能的逐步衰退为核心特征。在众多病理因素中，线粒体功能障碍已被公认为是AD发生和发展的一个关键诱因。这种功能障碍并非孤立存在，而是涉及由上游β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集、下游神经元内钙离子（Ca²⁺）稳态失调以及活性氧（ROS）过量产生所共同构成的一个正反馈恶性循环。具体而言，上游Aβ聚集体损伤线粒体膜，引发Ca²⁺大量内流与稳态失衡，从而进一步诱导ROS生成、加剧线粒体呼吸功能紊乱；而下游线粒体Ca²⁺失调与ROS过载又会反向促进上游Aβ的病理聚集，形成“Aβ-Ca²⁺-ROS”自放大恶性循环，最终导致神经元能量供应不足与细胞死亡。然而，目前的AD线粒体治疗策略通常只关注下游Ca²⁺的失调和ROS的过量产生，而忽略了上游Aβ的聚集毒性，严重限制了其治疗效果。另外，大多数用于AD治疗的线粒体药物无法区分正常神经元和受损神经元的线粒体，这可能会导致严重的治疗副作用。

近日，南开大学史林启教授与中国医学科学院放射医学研究所黄帆研究员团队合作，开发了一种具有序贯靶向功能的纳米分子伴侣（KAS-nChap），能够选择性地靶向受损神经元内线粒体，并通过打破线粒体损伤的自反馈恶性循环实现了阿尔茨海默病的高效治疗。在该策略中，团队通过在纳米分子伴侣表面修饰受损神经元靶向肽和线粒体靶向肽，使其能够首先定位于AD大脑中的受损神经元，随后靶向定位至其内部线粒体。定位完成后，纳米分子伴侣通过其表面模拟天然分子伴侣的疏水微域以及Aβ靶向肽的协同作用，高效结合Aβ蛋白聚集体并抑制其对线粒体膜的毒性，从而从源头上阻止了受损神经元内部下游线粒体Ca²⁺稳态失衡和ROS过载。此外，纳米分子伴侣表面修饰的线粒体靶向肽同时具备优异的抗氧化功能，能够辅助清除过量产生的ROS并调节Ca²⁺平衡，从而协同减轻Aβ诱导的线粒体损伤。最终，该纳米分子伴侣通过破坏AD线粒体微环境中“Aβ-Ca²⁺-ROS”的自放大反馈循环，有效地恢复了线粒体功能障碍，从而显著减轻了5xFAD转基因AD小鼠的神经元损伤和认知障碍。因此，该工作为逆转阿尔茨海默病的线粒体功能障碍提供了一种全新的治疗策略（图1）。

图1. 序贯靶向型纳米分子伴侣打破线粒体功能障碍正反馈循环用于治疗阿尔兹海默病示意图

研究团队首先利用不同靶向肽修饰的两亲性嵌段共聚物自组装制备了序贯靶向纳米分子伴侣（KAS-nChap）。具体来说，该体系由受损神经元靶向肽AAN修饰的聚合物AAN-PEG-b-PCL、线粒体靶向抗氧化肽SS-31修饰的聚合物SS-31-PEG-b-PCL以及Aβ靶向结合肽KLVFF修饰的聚合物KLVFF-PAE-b-PCL共同自组装而成。同时，团队还制备了无修饰肽的纳米分子伴侣（nChap）等作为对照组。动态光散射与透射电子显微镜表明所有纳米分子伴侣均具有均匀球形结构。斑点印迹实验结果进一步证实KAS-nChap对Aβ寡聚体展现出了优异的特异性识别结合能力。为了证实KAS-nChap的序贯靶向机制，团队通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术追踪了纳米分子伴侣在细胞内的定位。在受损神经元模型中，表面具有AAN修饰的KAS-nChap胞内荧光显著增强，证实其能高效地富集在受损神经元内。随后，得益于表面的SS-31肽对线粒体的特异性靶向，KAS-nChap表现出优异的线粒体共定位性能，完美实现了“受损神经元靶向-线粒体靶向”的序贯靶向过程（图2）。

图2. 纳米分子伴侣的自组装结构及序贯靶向性能表征

在成功定位至受损神经元的线粒体后，研究团队探讨了KAS-nChap阻断“Aβ-Ca²⁺-ROS”恶性正反馈循环的能力。免疫荧光实验结果表明，KAS-nChap得益于其表面的KLVFF肽与Aβ寡聚体结合，能够显著降低Aβ与线粒体外膜受体Tom-20的共定位，证明其有效阻断了Aβ寡聚体对线粒体膜的损伤。同时，针对Aβ寡聚体导致的线粒体钙过载，线粒体钙离子探针（Rhod-2）和线粒体渗透性转换孔（mPTP）探针的荧光检测结果表明，KAS-nChap治疗组能够有效抑制线粒体对Ca²⁺的异常摄取，恢复线粒体的离子稳态并逆转mPTP的异常开放（图3）。

图3. 纳米分子伴侣重塑受损线粒体钙离子稳态的研究

线粒体是细胞内产生ROS的主要细胞器，而异常升高的线粒体Ca²⁺会进一步加速ROS的产生，加剧氧化应激并诱发神经元死亡。为此，研究团队利用DCFH-DA和MitoSox作为特异性荧光探针评估了纳米分子伴侣清除细胞及线粒体内ROS的能力。实验结果证明KAS-nChap通过其表面的KLVFF肽以及抗氧化多肽SS-31的强效协同效应，能够有效地清除受损神经元内部过量的ROS，从而成功阻断由氧化应激介导的细胞损伤。为了进一步验证其治疗效果，文中评估了KAS-nChap对受损神经元细胞内线粒体损伤的修复能力。利用线粒体膜电位荧光探针JC-1和生物透射电子显微镜检测发现，KAS-nChap处理后，线粒体膜电位恢复正常水平且线粒体恢复了健康的结构，证实其修复了线粒体损伤。上述结果有力地证明了KAS-nChap通过各组分的协同效应，有效维持线粒体功能和结构完整性（图4）。

图4. 纳米分子伴侣降低细胞氧化应激与修复线粒体损伤的研究

为了进一步验证纳米分子伴侣的体内治疗效果，团队以5xFAD转基因小鼠为模型进行了研究。行为学相关的筑巢实验、新物体识别（NOR）和莫里斯水迷宫（MWM）实验结果表明，KAS-nChap治疗可显著提升AD模型小鼠的筑巢能力、新物体辨别指数与空间记忆能力，行为表现接近野生型正常小鼠水平（图5）。

图5. 纳米分子伴侣改善AD模型小鼠行为学的研究

最后，AD模型小鼠脑切片免疫荧光实验结果表明，KAS-nChap可有效地定位到小鼠脑神经元损伤区域，便于其高效地对脑病灶区域进行治疗。此外相关抗体指标染色结果证明KAS-nChap可显著减少脑内Aβ斑块沉积、降低氧化损伤标志物8-OHG水平。H&E、Nissl与NeuN染色结果显示，KAS-nChap可有效减轻海马区神经元萎缩、固缩等损伤，恢复神经元数量与形态，具有优异的脑神经保护作用（图6）。综上，该研究不仅为线粒体相关的疾病干预提供了一种高效的纳米平台，也为未来阿尔茨海默病的临床药物研发开辟了序贯靶向与多靶点协同治疗结合的新范式。

图6. 纳米分子伴侣调控AD脑内微环境及神经保护作用

该研究以“Sequential Targeting Nanochaperone Disrupts Positive Feedback Loop of Mitochondrial Dysfunction for Alzheimer's Disease Therapy”为题发表在Biomaterials上。南开大学史林启教授与中国医学科学院放射医学研究所黄帆研究员为本文通讯作者，南开大学博士研究生胡浩东为本文第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、天津市自然科学基金等项目的资助。

参考文献：

Sequential Targeting Nanochaperone Disrupts Positive Feedback Loop of Mitochondrial Dysfunction for Alzheimer's Disease Therapy

Haodong Hu, Shuyue Zhao, Linlin Xu, Zixuan Ma, Rujiang Ma, Fan Huang*, and Linqi Shi*