Adv Sci：陆军军医大学高铭萱等研究开发了一种用于高灵敏度检测乳腺癌患者外周血中的DNMT1活性的反应体系

DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNMT）介导，其活性的稳定性对细胞命运至关重要。DNMT1被认为是最有前景的研究靶点之一。然而，目前的检测技术尚无法准确定量其在外周血中的活性。

2025 年 5 月 2 日，陆军军医大学第一附属医院高铭萱、齐晓伟和陈鸣共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“Plasma DNMT1 Activity for Assessing Tumor Burden and Predicting Neoadjuvant Therapy Response in Breast Cancer”的研究论文。该研究开发了一种名为“DNMT1活性识别”（DIVA）的反应体系，用于高灵敏度检测乳腺癌患者外周血中的DNMT1活性。

DIVA可在低至10-7 U mL-1的浓度下，以最少的时间和成本检测到DNMT1。该方法已应用于271份临床样本的分析，成功评估了I-IV期患者的肿瘤负荷。最后，该方法还用于评估22例接受新辅助治疗患者的预后，结果与超声影像结果具有良好的一致性。DIVA有望成为乳腺癌早期发现和新辅助治疗评估的有效辅助技术。

乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的疾病，已成为女性健康及公共卫生体系的重大威胁。经过数十年的乳腺癌诊疗探索，新辅助治疗、外科手术、辅助治疗和放射治疗等技术已发展成熟，尤其新辅助治疗已成为局部晚期乳腺癌患者的标准治疗方案。然而，液体活检标志物在乳腺癌治疗反应预测和肿瘤负荷评估中的应用仍有待探索。表观遗传对肿瘤发生发展具有重要影响，而DNA甲基转移酶（DNMTs）通过DNA高甲基化调控表观遗传，被广泛认为是乳腺癌的重要病因之一。大量证据表明，包括DNA低甲基化或高甲基化在内的表观遗传修饰参与了乳腺癌的发生发展，其活性的稳定性在生长发育、基因组稳定性和细胞命运中起着至关重要的生理作用。

人类DNMTs家族主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，它们共同参与基因组甲基化的全过程。其中，DNMT1在复制过程中根据亲本DNA的甲基化模式，将特定的甲基化模式恢复到半甲基化链上，其在乳腺癌所有亚型中的过表达均可导致高甲基化和致癌性激活。同时，DNMT1还具有其他特异性的致癌作用，例如抑制雌激素受体、促进转移所需的上皮间质转化、诱导细胞自噬以及促进肿瘤干细胞的生长。与肿瘤表型（生长、迁移、侵袭等）的改变相比，DNMTs介导的基因表观遗传学改变发生于时间轴的上游，可能具有更好的预警能力。因此，我们假设检测DNMT1可以实现乳腺癌的早期预警和预后预测。

方案 1（图源自Advanced Science ）

然而，目前临床上对DNMT1的检测方法主要依赖酶联免疫吸附试验(ELISA)或免疫组化技术，这些技术可能不适用于在特定时间点检测血浆中的DNMT1。ELISA的灵敏度相对有限，并且无法量化血浆中的DNMT1酶活性。病理免疫组化(IHC)需要组织穿刺，这给患者带来了很大的负担，并且不能有效地解释组织形态的变异或由表型和生物学行为的差异可能引起的异质性影响。研究人员试图开发更灵敏的DNMT1检测方法。[25, 26]Xiao等开发了一种通过荧光偏振检测20nm DNMT1的高通量甲基化读取检测方法。[27] Guo等人采用指数扩增策略将DNMT1检测浓度提高到0.009 U mL−1。然而，这些报道的方法仍然无法区分人血浆中不同的DNMT1水平。因此，建立一种有效的血浆DNMT1检测方法，将单基线静态预测转化为诊疗过程中的早期动态评估，对乳腺癌患者的预后和生存至关重要。

本研究开发了一种模块化串联反应系统DIVA（DNMT1 Identification by Variable Activity，通过可变活性识别DNMT1），用于灵敏地检测人血浆中的DNMT1（方案1）。DIVA包含三个相互关联但又独立的模块：DNA甲基化、胞嘧啶脱氨和截短。在该系统中，我们设计了一个双链DNA（dsDNA）序列，该序列在DNMT1反应底物中间有两个交错的半甲基化CpG位点，而其余所有胞嘧啶位点均完全甲基化。在第一个模块中，DNMT1识别半甲基化的CpG位点并甲基化胞嘧啶；然而，由于DNMT1活性，部分底物仍处于未甲基化状态。然后产物在亚硫酸氢盐作用下进行脱氨基，其中每个未甲基化的胞嘧啶被转移到尿嘧啶上，而甲基化的胞嘧啶保持完整；随后，尿嘧啶在第三个模块中被 Afu 尿嘧啶-DNA 糖基化酶 (Afu UDG) 和内切酶 IV (endo IV) 截短。DNMT1 的差异活性被成功转化为 dsDNA 浓度的变化，从而可以通过 PCR 进行有效快速的区分，从而实现准确鉴定。DIVA 可以检测到低至 10−7 U mL−1 的 DNMT1。这种灵敏度足以直接检测乳腺癌患者血浆样本，这是以前未曾报道过的技术。DIVA 的检测时间约为 6 小时（从样本采集到获得结果），对患者的负担较小，与 IHC 分析（通常约 6 天）相比有显著改善。我们与我院乳腺及甲状腺外科合作，开展了一项前瞻性临床研究，应用DIVA技术成功评估了I至IV期乳腺癌患者的肿瘤负荷。进一步研究通过免疫组化分析揭示了DNMT1的潜在分泌来源。此外，DIVA技术有效地监测了新辅助治疗的疗效，其结果与超声检查结果一致。该DIVA方法为将血浆DNMT1作为乳腺癌临床肿瘤负荷评估和新辅助治疗疗效预测的监测指标开辟了新的视角。

参考消息：

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202501064