tRF-Pro-CGG对小鼠胰腺癌细胞生物学行为的影响及其分子机制

1.2.1  细胞培养和转染

上述细胞在37℃、CO2体积分数为5%的DMEM培养基中培养，该培养基含有10%的FBS、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素。将处于对数生长期的细胞以每孔2.5×105个细胞/mL的密度加入到6孔板中，用完全培养基培养1 d，直到密度达到80%。根据LipofectamineTM3000的使用说明书，用tRF-Pro-GG mimics及inhibitor转染相关细胞后培养24 h，进行后续实验。

1.2.2  RTFQ-PCR实验

利用TRIzol试剂（美国ThermoFisher公司）分离细胞中的总RNA，通过反转录总RNA和扩增试剂盒制备cDNA模板，并进行RTFQ-PCR扩增，扩增条件为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。本研究使用的引物购自广州锐博生物技术有限公司，U6被用作内部参考。tRF-Pro-CGG引物的正义链为5‘-GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATG-3‘，反义链为5‘-ACGTGTGCTCTTCCGATCTGAA-3‘；U6引物的正义链为5‘-GCTTCGGCAGCACAT ACTAAAAT-3‘，反义链为5‘-CGCTTCACGAA TTTGCGTGTCAT-3‘。利用2-ΔΔCt计算tRF-Pro-CGG的平均相对表达水平。

1.2.3  CCK-8实验

将对数生长期的细胞以1×104个细胞/孔均匀铺设于96孔板中，每孔体积为100 μL，细胞附壁后分别于第0、24、48、72和96 h加入10 μL CCK-8试剂，外围孔填充磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS），将96孔板置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中温育2 h，测量450 nm处细胞的吸光度（D）值。 

1.2.4  Transwell迁移和侵袭实验

将处于对数生长期的细胞饥饿6 h，用无血清培养基将50 mg/L的matrigel按1∶8的比例稀释，使用前与培养基混合，用胰蛋白酶消化细胞后用含有10%FBS的完全培养基终止消化，细胞以10  000 r/min离心5 min后弃去上清液，PBS洗涤2次后用无血清培养基重新悬浮。细胞计数后在含有基质和不含基质的上腔室中分别加入5×104个细胞，体积均为500 μL。将腔室放入24孔板中，并在下腔室中加入700 μL含有10%FBS的完全培养基，细胞在37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养24 h，随后取出腔体放入新的孔中，并用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛溶液固定15 min后，用800 μL 0.5%结晶紫染色液染色20 min，干燥后在显微镜下对细胞进行计数并拍照。

1.2.5  动物实验

选取5周龄雌性BALB/c裸鼠随机分为4组（每组9只），将过表达tRF-Pro-CGG（tRF-Pro-CGG mimics组和NC mimics组）的pan02细胞及敲低tRF-Pro-CGG（tRF-Pro-CGG inhibitor组和NC inhibitor组）的LTPA细胞分别经皮下注射到裸鼠体内，每只裸鼠注射浓度为5×106个细胞/mL的0.2 mL单细胞悬液，建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。利用动物活体成像系统观察并记录肿瘤生长情况，取下瘤体后称重，将瘤体在4%多聚甲醛溶液中固定后常规做H-E染色。建立裸鼠胰腺癌肝转移模型，随机分为4组（每组5只），将过表达tRF-Pro-CGG（tRF-Pro-CGG mimics组和NC mimics组）的pan02细胞及敲低tRF-Pro-CGG（tRF-Pro-CGG inhibitor组和NC inhibitor组）的LTPA细胞分别经尾静脉注射到裸鼠体内，每只裸鼠注射浓度为2×106个细胞/mL的0.2 mL单细胞悬液，每隔4 d经尾静脉追加上述各组细胞，10周后处死解剖裸鼠并观察胰腺癌肝脏转移瘤的结节个数。

1.2.6  蛋白质印迹法（Western blot）实验

收集各组稳定转染tRF-Pro-CGG的细胞或液氮研磨肿瘤组织，添加裂解液（美国Sigma-Aldrich公司）后从细胞或组织中提取总蛋白，用二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒检测蛋白浓度，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）将蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶密封4 h，加入抗tRF-Pro-CGG、Ki-67、抗vimentin、抗E-cadherin、抗PI3K、P-PI3K、抗AKT及P-AKT的一抗4℃温育蛋白过夜，含有吐温-20三乙醇胺缓冲盐溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗涤后加入二抗，在常温下温育1 h，最后加入免疫印迹化学发光试剂后凝胶成像曝光，以β-肌动蛋白为内部对照，用ImageJ软件分析目标蛋白的灰色值。

图1  tRF-Pro-CGG在小鼠胰腺癌细胞系pan02、LTPA及人胰腺癌细胞系Capan-2中的表达

Fig. 1 tRF-Pro-CGG expression in mouse pancreatic cancer cell lines pan02 and LTPA, as well as human pancreatic cancer cell line Capan-2

**: P＜0.01, compared with HPDE6-C cell line.

图2  过表达及敲低tRF-Pro-CGG后pan02细胞tRF-Pro-CGG表达

Fig. 2 Expression of tRF-Pro-CGG in pan02 cells after overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG

A, B: RTFQ-PCR was used to detect mRNA expression of tRF-Pro-CGG in each group; C, D: Western blot was used to detect protein expression of tRF-Pro-CGG in each group. ***: P＜0.001, compared with NC mimics or NC inhibitor by RTFQ-PCR; **: P＜0.01, compared with NC mimics or NC inhibitor by Western blot.

图3  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对pan02细胞增殖的影响

Fig. 3 Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on the proliferation of pan02 cells

A, B: CCK-8 was used to detect changes of cell Proliferation in each group. **:P＜0.01, compared with NC mimics or NC inhibitor.

图4  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对pan02细胞迁移和侵袭能力的影响

Fig. 4 Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on migration and invasion ability of pan02 cells

A-C: Transwell was used to detect changes of cell migration and invasion in each group; ***: P＜0.001, compared with NC mimics or NC inhibitor.

图5  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响

Fig. 5 Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on the growth of pancreatic cancer transplant tumors in nude mice

A-C: Effects of overexpression of tRF-Pro-CGG on tumor volume, weight and body weight of nude mice; D-F: Effects of knockdown of tRF-Pro-CGG on tumor volume, weight and body weight of nude mice. **: P＜0.01, compared with NC mimics or NC inhibitor.

图6  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对裸鼠胰腺癌移植瘤组织形态结构的影响

Fig. 6 Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on the morphological structure of transplanted tumor tissues in nude mice with pancreatic cancer

A, B: H-E staining was used to detect changes of histomorphological structure of pancreatic cancer transplantation tumor in nude mice in each group.

图7  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对Ki-67增殖指数、vimentin和E-cadherin表达的影响

Fig. 7 Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on Ki-67, vimentin and E-cadherin expression

A, B: Western blot was used to detect Ki-67 proliferation index, expression of vimentin and E-cadherin in each group. ***:P＜0.001, compared with NC mimics or NC inhibitor.

图8  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT表达的影响

Fig. 8 Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on the expression of PI3K, P-PI3K, AKT and P-AKT

A, B: Western blot was used to detect protein expression of PI3K, P-PI3K, AKT and P-AKT in each group. ***: P＜0.01, compared with NC mimics or NC inhibitor.

图9  过表达及敲低tRF-Pro-CGG对裸鼠胰腺癌肝转移的影响

Fig. 9  Effects of overexpression and knockdown of tRF-Pro-CGG on liver metastasis of pancreatic cancer in nude mice

随着高通量二代测序技术的快速发展，大量的sncRNA尤其tRF分子被发现广泛存在于人类疾病中，如癌症、遗传性代谢疾病、神经退行性疾病及病毒感染等。tRF在不同疾病中发挥着不同的生物学功能，特别在各类肿瘤中的表达及生物发生机制也略有差异，且对于肿瘤发生、发展的探索仍停留在初步阶段。随着人们生活方式的改变及工作强度的增加，患消化道肿瘤的概率也显著提高。胰腺癌是恶性程度高、预后差的消化系统恶性肿瘤之一，其患病率和死亡率均较高，手术是治愈胰腺癌的唯一希望，但超过80%的胰腺癌患者就诊时已丧失了手术治疗的机会［6-7］。胰腺癌转移早、进展快、局部浸润等特点使其治疗效果并不显著，因此寻找新的肿瘤标志物和有效的治疗靶点非常必要。

近年来tRNA中衍生出一类独特的sncRNA，其被分为tiRNA和tRF两大类，在人体内有着重要的生物发生和肿瘤特性［8］。根据匹配的区域和长度大小，其tRF可分为tRF-1、tRF-2、tRF-3、tRF-5和i-tRF亚型［9］。tRF在许多癌症中发挥重要功能。在乳腺癌中，2-tRF可以与YBX-1相互作用，对乳腺癌细胞增殖产生抑制作用［10］。在前列腺癌中，Zeng等［11］研究发现，tRF-1001表达水平升高，促进癌细胞从G2期到M期，提高癌细胞的增殖速度。在结直肠癌中，tRF/miR-1280可以阻止结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移［12］。在胃癌中，tRF-38和tRF-18则充当促癌基因的角色［13］。此外，tRF-03357可明显促进卵巢癌的进程［14］。大多数tRF在缺氧环境中产生致癌应激反应，这与胰腺癌的缺氧微环境相匹配［3］，说明tRF的形成条件与胰腺癌密切相连。然而，tRF在胰腺癌中的相关机制研究报道较少。

本课题组前期研究［4］发现，tRF-Pro-CGG在人胰腺癌组织与癌旁组织中差异表达最明显，京都基因和基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析显示，tRF-Pro-CGG下游的PI3K/AKT通路的富集密度最高，相关性最大。此外，tRF-Pro-CGG的低表达与胰腺癌患者的不良临床结局密切相关，也预示着tRF-Pro-CGG作为抑癌基因影响胰腺癌的发生、发展［5］。本研究采用tRF-Pro-CGG转染tRF-Pro-CGG mimics或tRF-Pro-CGG inhibitor，采用RTFQ-PCR和Western blot实验检测了tRF-Pro-CGG在pan02及LTPA细胞中的表达量，CCK-8和transwell实验表明，过表达tRF-Pro-CGG可以抑制小鼠胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。体内裸鼠移植瘤实验结果显示，过表达tRF-Pro-CGG能显著抑制瘤体重量和体积。Ki-67增殖指数可反映肿瘤细胞的增殖水平，其与癌症分期密切相关，癌症的侵袭和转移常伴随着vimentin的增加和E-cadherin的减少［15］。本研究表明，过表达tRF-Pro-CGG可有效抑制移植瘤组织中Ki-67增殖指数和vimentin的表达，而促进E-cadherin的表达。PI3K/AKT信号通路是调控肿瘤增殖和凋亡的重要通路之一，参与人类许多肿瘤的发生、发展［16］。Ebrahimi等［17］指出， PI3K/AKT信号通路在胰腺癌的发生、进展和转移中发挥着关键作用。本研究的Western blot实验证明，过表达tRF-Pro-CGG明显抑制PI3K、AKT的磷酸化水平，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，抑制小鼠胰腺癌移植瘤的生长。

综上，过表达tRF-Pro-CGG能抑制小鼠胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。过表达tRF-Pro-CGG可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路，从而抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长。过表达tRF-Pro-CGG抑制胰腺癌移植瘤中增殖、侵袭转移蛋白的表达。本研究表明，tRF-Pro-CGG在裸鼠胰腺癌的发生、发展中发挥重要作用，有望为胰腺癌早期诊断和治疗提供新的线索。