鲁凤民教授：抗HBV特异性免疫与慢乙肝治愈

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国重大公共卫生问题，其疾病进程具有“感染年龄早、病程周期长、免疫博弈复杂”的中国人群特征。

近日，北京大学感染病研究中心基础医学院病原生物学系鲁凤民教授结合我国HBV感染流行病学特点、病毒-宿主免疫互作机制及临床诊疗数据，系统分析慢性HBV感染从免疫耐受到肝硬化、肝癌的进展规律，重点探讨了病毒cccDNA沉默、整合事件、免疫细胞功能异常对疾病结局的影响，并基于现有临床证据提出分层治疗与治愈目标的优化策略。肝胆相照平台特将精华整理成文，以飨读者。

01 慢性感染是HBV的主要致病模式

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染相较于丙肝而言，是一个更加漫长的疾病过程，从慢性HBV感染进展至肝硬化、肝癌，通常需30-50年时间。需重点强调的是，中国慢性HBV感染具有显著的人群特征：即我国的慢性乙肝感染多源于围产期及婴幼儿早期，感染者的感染时间与年龄基本一致，这与西方国家存在本质差异。

因此，在评估国外指南及研究结果并应用于中国的临床实践时，需充分考量这一特征。相较于遗传背景、HBV基因型的差异，更重要的是我国慢乙肝患者往往有着更长的病毒与宿主免疫系统的博弈周期，这才是影响疾病进展、抗病毒治疗应答和难以获得功能性治愈的关键影响因素。

自1992年实施新生儿乙肝疫苗接种以来，我国的HBV感染流行病学特征已发生明显的变化。王宇教授团队近期发表的研究显示（图1），我国HBV新发感染已显著减少，当前慢性感染人群以1992年前的即存感染者为主，占比达92%。

该部分人群已历经30年以上的病毒-宿主免疫互作。已知HBV无直接致细胞病变作用，肝损伤主要由宿主免疫系统清除病毒时，对感染肝细胞的清除过程所引发。加之肝脏具有强大的代偿性增殖能力，这种持续的免疫清除过程会导致患者肝脏出现反复的细胞死亡与再生循环，这是HBV相关肝损伤的主要原因。

在此过程中，那些整合了HBV DNA片段的肝细胞往往因增殖优势而形成克隆性细胞扩增集落，伴随细胞增殖的突变积累不仅使患者的肝细胞癌（HCC）发病风险增加，因整合片段的HBsAg表达特性也使得慢性乙肝的功能性治愈面临更大的挑战。

我们注意到，45岁以上人群中血清HBV表面抗原（HBsAg）HBsAg阳性率的变化，尽管不排除与乙肝相关疾病导致的寿命缩短有关，但同时也提示了宿主免疫系统在长期的与病毒博弈过程中，逐步实现病毒控制与清除、发生慢性感染自我清除的情况。

图1 中国乙肝流行率比较（1992-2020）

02 自然史中的cccDNA的缓沉默、和更艰难的血清HBsAg阴转

2005年，中国第一版慢性乙型肝炎诊疗指南将治疗策略从抗炎转向抗病毒，至今已近20年，期间治疗主要药物为核苷（酸）类似物（NA），并在控制疾病进展减少终末期肝病发生上取得了显著的成就。

在慢性乙肝治愈方面，中国最早在临床实践中进行了探索，如宁琴教授团队开展的OSSA、OSST等的相关研究表明，血清HBsAg定量<1500IU/mL的NA经治人群是追求治愈的潜在优势人群，该理念在“珠峰项目”中也得到验证，并发现血清HBsAg定量越低，患者治愈的可能性越高。据佑安医院涵盖约7万例患者的未公开发表检测结果显示，检测人群中HBsAg定量<1500IU/mL的人群占比已超过50%（图2）。

图2 二十年的NA治疗，以血清qHBsAg水平看治愈优势人群的占比在增加

需要强调的是，慢性HBV感染的自然清除率较低，核心原因在于慢性感染者肝内的HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的清除/沉默过程缓慢。我国台湾地区一项研究显示，当患者出现加速性HBsAg清除时，回溯发现其血清HBsAg消失前的HBV核心相关抗原（HBcrAg，反映cccDNA转录活性）从下降到完全清除需要10-15年之久；而在这之前的25-29年，HBV DNA已呈阴性（图3）。HBV DNA检测不到但仍能检出HBcrAg，且HBsAg清除更为困难。这提示我们，依靠自发的宿主免疫完全清除病毒或使之转录沉默，是极为困难的，且往往以经久持续的免疫病理损伤为代价。

图3 来自台湾的自人群随访观察队列

1. 病毒因素

为何在HBV DNA不能有效复制后，HBcrAg、HBsAg下降/清除仍然如此艰难？

我们认为存在两方面的关键原因：一是炎症会促进细胞增殖及携带HBV整合片段的细胞增殖；二是HBsAg来源具有多样性。HBcAg及HBcrAg仅来源于cccDNA（由3.5k转录本表达），而HBsAg既可来源于cccDNA，也可来源于HBV DNA整合片段，且HBV DNA整合事件会伴随着整个的疾病进程（图4）。

图4 HBV的生命周期

从病毒颗粒构成来看，HBV病毒颗粒（含DNA）与亚病毒颗粒（主要由HBsAg构成，不含DNA）中，病毒颗粒占比最低（约10⁹拷贝/ml），亚病毒颗粒占比极高（可达10¹⁴拷贝/ml）。当无 HBV DNA聚合酶（P 蛋白）表达时，无法形成病毒 DNA，这是 HBV DNA 早于 HBcrAg 消失的重要原因。在HBeAg阴性患者中，整合来源的HBsAg已占主导地位，这与炎症引发的细胞死亡-再生循环使得携带整合HBV DNA片段的细胞克隆性增殖密切相关。

2. 病毒与宿主免疫互作的因素

HBV整合是HBV致癌的重要机制：整合可导致插入突变、染色体不稳定性，且整合的HBV DNA可表达HBsAg及羧基端缺损的HBx蛋白。需要注意的是，在HBV相关肝癌的发生、发证过程中，HBV整合的直接贡献为10%-40%，而60%-90%的肝癌与持续肝脏炎症有关。

在我们于2013年发表在P LOS ONE 的研究中，通过对比肝癌组织与癌旁组织的HBV整合事件发现，癌旁组织的整合检出频率远高于肝癌组织。对此的解释为：肝癌组织多为单一克隆来源，而癌旁组织存在多个增生细胞集落，每个集落均可能存在其独特的HBV整合特征。

2013年发表于 J. of Hepatology 的后续研究进一步明确，HBV整合致癌的主要机制是破坏抑癌基因（如TP53基因）或激活原癌基因，且该机制在非肿瘤组织中的发生率达20%（图5），提示HBV整合后并非必然发展为肿瘤，需经历长期慢性炎症过程。

图5 整合致癌机制：对抑癌基因功能的破坏或原癌基因的激活

急性HBV感染一般不会引发持续的炎症与细胞增殖，而在慢性感染过程中，宿主免疫功能不足以完全清除病毒，但仍具备一定的病毒及感染肝细胞清除能力，这种迁延不愈的炎症状态会导致细胞反复死亡-再生。携带HBV整合片段的肝细胞会形成细胞克隆，凭借增殖优势实现持续增生，伴随突变积累，最终增加肝癌发生风险。

除cccDNA外，疾病晚期阻碍治愈的关键因素是HBV整合事件，这是因为整合来源的HBsAg会阻碍功能性治愈及HBsAg自发清除的实现。因此，早期开展抗病毒治疗具有重要意义。2022版慢性乙型肝炎诊疗指南推荐更广泛的治疗人群（如30岁以上HBV DNA阳性者），虽无法清除已发生的整合事件及整合肝细胞克隆，但可更早地有效阻止新的整合事件发生（图6）。

图6. 病毒与宿主免疫互作所致持续炎症：促进携带整合的肝细胞增殖

HBV慢性感染致病的核心在于肝脏炎症，免疫介导的肝损伤是疾病进展的重要驱动因素。但随着HBV DNA下降、HBsAg缓慢下降，肝脏炎症得到缓解。然而，由于宿主抗HBV特异性免疫功能不足，以致HBsAg血清学转换发生率较低，且过程漫长。即使是在非活动性HBsAg携带者（IHC）中，年发生率也仅1%-3%。

当前中国慢性乙型肝炎患者中，HBeAg阴性患者已占主体，推测占比60%-70%甚至更高（2006年的全国流调数据数据已达60%）。结合大数据分析，HBeAg血清学转换的主体年龄约41岁。

需要注意的是，从肝组织抗原表达来看，HBeAg阳性转为HBeAg阴性后，肝细胞内HBcAg阳性比例显著下降（从17%降至3.7%），而HBsAg阳性比例不仅未下降，反而从6.3%升至7.5%。血清HBsAg水平下降但肝组织内HBsAg阳性细胞比例升高，其原因与整合来源的大、中、小HBsAg 的比列变化所致HBsAg分泌障碍有关，后续将进一步阐述。

3. CHB患者宿主特异性抗HBV体液免疫功能异常和免疫细胞功能耗竭

长期高水平得HBsAg暴露会影响免疫系统功能：

一方面，虽存在针对HBsAg的B细胞及浆细胞，但无法有效产生并分泌HBsAb，提示B细胞的功能缺陷可能主要不是功能耗竭，而是成熟发育异常，而造成此现象的核心原因则是抗原呈递过程异常；

另一方面，针对HBsAg的细胞毒性T细胞（CTL）存在随年龄增长的耗竭现象，且具有统计学意义（P=0.01），但相关性较弱（r=0.3），其他免疫细胞亚群无显著变化，仅HBsAg特异性CTL占比显著减少。

对比不同年龄段CTL特征发现：25-30岁人群中，HBsAg特异性CTL占比约22%，且呈下降趋势；HBeAg阴转后，该比例进一步下跌至4%，相较于青少年时期下降近10倍；而针对HBcAg的CTL占比则呈持续升高趋势。

这一结果证实，长期HBsAg暴露会导致HBsAg特异性CTL占比显著下降。由于HBsAg特异性CTL占比减少，以致尽管这些肝细胞表达HBsAg，宿主免疫系统仍难以有效地清除携带整合片段的肝细胞；而针对HBcAg的CTL持续保持较强的清除活性，因此表达HBcAg的肝细胞显著减少（图7）。

图7 宿主抗HBV特异性细胞免疫活性的随年龄变化

近期的多项研究均显示，尽管HBeAg阴转后患者的血清HBsAg水平显著下降，但肝组织内HBsAg阳性细胞比例并无显著下降，造成这种血清HBsAg水平与肝组织内表达强度不一致的核心机制是HBsAg分泌效率改变。

我们近期的发表于 Hepatology Research 的相关研究显示，HBV DNA整合造成其核心启动子（BCP）缺失，负责调控其转录活性的增强子I通过缺失再扫描机制转而上调大S抗原对应的SP1启动子，并因此增加了大HBs（L-HBs）的表达，过多的L-HBs会抑制HBsAg分泌，导致肝细胞内HBsAg蓄积和分泌至血清中的总HBsAg显著减少。而另一方面，尽管针对HBV P蛋白的免疫细胞持续占有较高的比例，但由于P蛋白转录表达过程中即会被核衣壳包裹，难以被免疫系统识别，因此其在清除感染肝细胞过程中虽有作用，但并非主要效应分子。

HBeAg阳性转为HBeAg阴性后，HBcAg阳性肝细胞比例从17%显著降至3.7%，但未完全阴转，原因如下：

一是当HBV发生G1896A位突变时，HBeAg前体蛋白p25因终止密码子的提前出现而翻译受阻，分泌型HBeAg的消失会导致抗原刺激减少；

二是发生G1896A位突变后，原本翻译表达HBeAg前体蛋白p25的3.5k前C mRNA转录本通过翻译终止再起始机制转而表达核心蛋白（HBcAg），核心蛋白是构成病毒核衣壳的关键成分，有助于HBV的复制（图8）。真核细胞中的翻译终止再起始的相关分子生物学机制已有多篇文献报道，以微小染色体为复制源头的HBV转录本的翻译同样遵循该规则。的确如预期的那样，本实验室和其他团队针对临床队列的HBV突变分析发现：随疾病进展，携带HBV G1896A突变的患者比例随年龄的增长而逐渐增加，并在发生HBeAg阴转后现在增加（图9）；

三是HBcAg可能发生适应性突变，导致其无法被宿主已有的针对野生型核心抗原的细胞免疫所识别，从而逃避细胞免疫清除。

图8 BCP突变的意义

图9 宿主抗HBV特异性细胞免疫压力下的病毒变异

总体而言，随着HBeAg的阴转和血清学转换，患者肝组织中的感染肝细胞数量呈下降趋势；再者，由于HBV基因组不同功能域的高度重叠特性，适应性突变能力有限，以致上述这些突变通常以病毒复制能力的下降为代价。而在病毒载量（包括HBsAg水平）下降的同时，肝脏炎症也会缓解，但适应性突变回导致免疫识别障碍，使得表达HBcAg的肝细胞不能被完全清除。

03 慢乙肝临床治愈之路

未来乙肝治愈的关键在于特异性细胞免疫增强，相关证据包括：宁琴教授团队近期研究显示，停药时HBsAb水平越高，停药后更宜维持HBsAg的阴性；CTL（尤其是HBsAg特异性CTL、HBcAg特异性CTL）在病毒清除中发挥核心作用（图10）。

另有研究显示，清除B细胞后，乙肝复发率显著升高；张继明团队近期研究表明，停药后更强的细胞免疫活性有助于维持HBsAg阴性状态，并提高HBsAg清除率。

这提示我们，实现治愈需更强的靶向性免疫调节（如针对HBsAg、HBcAg的免疫应答增强），同时需更强效的抗病毒药物（如高效抑制HBV DNA复制和病毒抗原表达的直接抗病毒药物）。

图10 停药点更高的抗-HBs水平利于患者HBsAg持续消失和功能性治愈的获得

理论上讲，免疫重建的治愈患者若HBsAg特异性CTL、HBcAg特异性CTL及HBV P蛋白特异性CTL均能有效增强，可清除所有感染肝细胞，但鞋带cccDNA及整合HBV DNA的肝细胞仍无法完全清除。其核心原因可能是cccDNA可进入转录静默状态，免疫系统无法识别DNA本身，仅能识别病毒蛋白（如HBsAg、HBcAg），当cccDNA完全沉默病毒蛋白表达消失时，免疫清除作用即失效。以致实现临床治愈（血清HBsAg检测不到）的患者中，最高68%的肝细胞内可检测到cccDNA的存在，甚至20%的治愈患者仍有肝细胞表达HBsAg。这提示临床治愈与病毒学根治仍存在差距。

最后，临床治疗中需根据疾病不同阶段进行分层，设定差异化治愈目标：早期的组织学免疫耐受状态下以治未病为主，通过抗病毒治疗阻止整合和肝脏炎症发生；若已进入存在活跃肝脏炎症的慢性肝炎状态，则需加速阻止病毒复制、和控制炎症，阻止新的整合事件发生，同时降低病毒负荷。最后，为追求最终的临床治愈、未来我们需研发更具靶向性的免疫调节药物，同时开发更强效的直接抗病毒药物，以实现更为广泛的慢性乙型肝炎的临床治愈（图11）。

图11 疾病进程不同的阶段、不同的病毒与宿主特征、不同的阶段性治疗目标与策略