预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效生物标志物的研究前沿与热点分析

摘  要

目的　分析预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效生物标志物研究的发展现状，为后续研究提供参考。方法　计算机检索 Web of Science核心合集 2017—2021 年收录的预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的生物标志物研究。通过 CiteSpace对该领域文献的年度分布、期刊、作者、国家、机构、关键词等进行可视化分析。结果　共纳入426篇文献，包括 298 篇论著、128 篇综述。年平均发文量约为 85 篇，发文量呈逐年增加趋势。细胞程序性死亡配体 1（PD-L1）表达、肿瘤突变负荷、肿瘤微环境、液体活检等为该领域的热点关键词。结论　未来将液体活检、肿瘤微环境生物标志物与影像组学分析联合起来，对非小细胞肺癌患者体内淋巴细胞的免疫状态以及病灶特征等肿瘤相关信息进行更加精准的评估可能是该领域的研究热点及前沿。

正  文

肺癌是最常见的肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的主要原因[1-2]，大多数 （80%～90%）肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），最常在疾病晚期（65%）时被诊断出来，并可能已经出现局部或远处转移[3]。最近应用免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）的免疫疗法被证明可有效改善NSCLC患者预后[4]，但并非所有患者都能从免疫治疗中获益[5]。因此，为预测免疫治疗临床反应，需开展更多相关生物标志物的研究。这些生物标志物能监测体内物质、结构或过程产物等[6]，从而对免疫治疗的效果进行预测。

CiteSpace软件是由美国德雷塞尔大学陈超美团队开发的文献计量学分析工具[7]，能够对学术数据库的数据进行定量分析，从而了解该研究领域的研究动态。本研究通过CiteSpace对预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物研究领域的热点及趋势进行可视化分析，希望为国内学者的研究提供参考。

1　资料与方法

1.1   数据采集

选取Web of Science（WoS）核心合集作为文献检索平台，检索时限为2017—2021年，检索方式均为主题词，检索式：TS=（（“non-small lung cancer”or “NSCLC”）and “predict*”and（“response”or “efficacy”）and “immunotherapy”and “biomarker*”），文献类型为论著和综述。

1.2   数据分析

将在WoS核心合集检索到的全纪录与引用的参考文献以Text的格式导出。通过CiteSpace 6.1.R2（64-bit）对文献的国家、机构、作者、关键词、被引文献等进行全面分析。

2　结果

2.1   WoS核心合集年度发文量

检索到匹配的文献共426篇，包括298篇论著、128篇综述，均为英文文献。年平均发文量约为85篇，发文量呈现逐年递增趋势（图1）。表明预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物研究正在逐渐得到重视。

图1　预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的生物标志物研究文献数量的年度分析

2.2   来源期刊分布情况

筛选出的426篇预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物研究的文献在146个期刊发表，其中发文量位居前10的期刊的JCR分区、发文量、影响因子及数量占比见表1。

2.3   国家机构合作可视化

运行CiteSpace软件，选择国家分析，得到知识图谱共41个节点，99条连线（图2），图中每个圆形节点代表一个国家，圆形节点的大小反映国家发文数量多少，节点之间的连线代表国家间的合作关系，连线的粗细反映合作关系的紧密程度，节点的不同颜色代表不同的年代[8]，紫色圈的大小反映国家的影响力中心值。表2显示发文量排名前5的机构，分别是上海交通大学、华中科技大学、德克萨斯大学安德森癌症中心、中山大学、中国医学科学院北京协和医学院。图2及表2反映出我国研究者在该研究领域做出了一定的贡献，与美国相比，虽然发文量领先，但在中心值上仍有较大差距，我们需要更多与他国合作，扩大自身的影响力。

图2　预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的生物标志物研究的国家可视化图谱

2.4   作者合作可视化

运行CiteSpace软件，通过WoS 数据库筛选出的文献，对该领域的作者团队合作网络进行共现分析，该研究领域发文量前5的作者及其所属机构见表3。

2.5   关键词共现分析

关键词的相关分析作为可视化分析图谱中最具有指导性的内容，对明确该领域研究热点及前沿至关重要。运行CiteSpace软件，节点类型采用作者关键词，得到294个节点、793条连线的关键词共现图谱（图3）。去除其中部分与检索策略重复的主题词，分析该领域关键词的共现频次及其中心值可知，热点关键词为细胞程序性死亡配体1表达（PD-L1 expression）、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden）、表皮生长因子受体突变（EGFR mutation）、肿瘤微环境（tumor microenvironment）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA）、液体活检（liquid biopsy）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte）、中性粒细胞/淋巴细胞比值 （neutrophil-to-lymphocyte ratio）、CD8+ T 细胞、18F-FDG PET/CT、免疫相关不良反应（immune-related adverse events，irAEs）、生物信息学（computational biology）、影像组学（radiomic）等。

图3　预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的生物标志物研究的关键词可视化图谱

2.6   关键词突显分析

关键词突显研究分析能了解该研究领域的研究前沿，对于总结预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物研究领域近年来的研究方向并推断未来研究热点有重要作用。运行CiteSpace软件，以0.2的γ值进行突显分析，得到前21个突显词。结果显示，2019—2021年，特征（signature）、预后价值（prognostic significance）、淋巴细胞（lymphocyte）、DNA、联合（combination）、预后（prognosis）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA）、敏感性（sensitivity）被使用的次数增加。

2.7   被引文献

WoS数据库筛选出的相关文献总计426篇文献，共被引用10 174次，平均每篇文献被引用24次，被引频次排名前10的文献见表4。

3　讨论

寻找ICI的临床获益指标涉及到从传统的病理学到分子生物学的各个领域。随着基因测序平台的技术进步和分析复杂数据集的生物信息学工具的可用性，研究者们已在肿瘤细胞、血液和健康组织中，甚至在细胞和分子水平上对假定的反应生物标志物进行了探索。根据所提取出的高频重点关键词的内容进行了梳理和总结，得出了目前的研究热点主要集中于肿瘤相关生物标志物、肿瘤微环境相关生物标志物、宿主相关生物标志物、影像组学相关生物标志物这几个方面。

3.1   肿瘤相关生物标志物

3.1.1   PD-L1 肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score，TPS）

PD-L1 表达是开发的第一个反应生物标志物，也是迄今为止Ⅳ期无驱动基因突变的NSCLC患者指导治疗的首要选择[19]。目前临床上使用免疫组织化学方法对肿瘤标本进行 PD-L1 TPS评估存在一些局限性：即使在同一肿瘤病变，其在组织中的表达在时间和空间上高度可变。在临床实践中，该标志物的效用也有限，因为不表达 PD-L1 的患者可能对 PD-1 或 PD-L1 检查点抑制剂有反应，相比而言，一些 PD-L1 表达升高的患者却并未从这些药物中受益。Yu 等[20]的研究显示在接受过全外显子组测序的NSCLC患者中，肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）结合PD-L1表达的联合使用与单独的PD-L1表达相比具有较高的预测价值，包括对无进展生存期、免疫治疗完全反应、部分反应预测方面，总结出组织中 PD-L1 表达和TMB的联合使用是评估患者生存率和免疫治疗反应具有前景的生物标志物。综合考虑，PD-L1表达单独使用效力有限，需要寻找更优的生物标志物进行综合评估。

3.1.2   肿瘤突变负荷

TMB被定义为癌症基因组编码部分内非同义突变的数量，当使用靶向二代测序平台进行评估时，TMB 被视为可用于新抗原负载的最佳替代物[21]。作为较新的候选生物标志物，与 PD-L1 TPS 相比，前瞻性验证的结果很少，而且结论往往不一致。值得注意的是，有研究[22]显示高 TMB 患者的免疫治疗无进展生存期获益与 PD-L1 表达无关。然而基于 KEYNOTE-158 试验预先计划的回顾性分析[23]的总体反应率，2020年6月，美国食品药品监督管理局批准了帕博利珠单抗（pembrolizumab）应用于在一线化疗失败时，晚期实体瘤且组织 TMB 高的患者（≥每兆碱基10个突变，使用 FoundationOneCDx 或 MSK-IMPACT 测定评估）。此外，通过对肿瘤和免疫细胞的分析，发现克隆 TMB（即每个癌细胞中非同义突变的数目）在预测对 ICI 的敏感性方面优于TMB[24]。因此，需要在大规模前瞻性试验中进一步验证TMB作为免疫治疗疗效预测生物标志物的价值。

3.2   肿瘤微环境相关生物标志物

3.2.1   T淋巴细胞浸润

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是由肿瘤、基质和肿瘤浸润免疫细胞的有机复合体组成的，其中T淋巴细胞浸润涉及多种细胞类型和细胞因子的复杂网络，是免疫识别的标志。大量研究[25]表明，活化的 CD8+T 细胞是参与抗肿瘤免疫的主要参与者，在一部分肿瘤中，癌细胞会通过表达诸如PD-L1等与抑制性检查点结合的配体来抑制CD8+细胞毒性T细胞的激活，这被认为是癌细胞免疫逃逸的一个重要机制。TME 免疫细胞上的 PD-L1 表达，包括骨髓细胞（巨噬细胞、树突状细胞）和 T 细胞[26]，似乎与 ICI 反应的相关性比肿瘤细胞上的表达更密切[27]。然而在 NSCLC 临床实践中，组织学表征 T 淋巴细胞浸润的一个限制是肿瘤组织的稀缺，这影响了对T淋巴细胞在影响 ICI 反应方面的深入了解。

3.2.2   癌症相关成纤维细胞

成纤维细胞在器官形成和组织结构、功能的完整性中起重要作用。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）通过有效的免疫抑制活性在肿瘤的起始、进展、转移和治疗耐药性中发挥关键作用[28]。CAF 标志物主要与 T 细胞免疫抑制相关，阻断 CD8+T 细胞和自然杀伤细胞的作用，尤其是通过释放各种趋化因子和细胞因子（主要是 IL-6 的产生），导致临床治疗结果不佳[29]。随着CAF和TME对免疫细胞的作用以及对癌症免疫疗法效率影响的研究不断深入，研究者们可以开发出针对这些目标的新型化合物，从而为免疫治疗提供了新的思路。

3.3   宿主相关生物标志物

3.3.1   循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）是具有肿瘤特异性信息的完整活细胞，也可以用于癌症诊断和治疗评估。一些作者[30]研究了基线CTC 与总生存率之间的关系，发现大量 CTC 与死亡和进展风险增加之间存在关联。此外，在 ICI 治疗前存在 PD-L1 阳性表达的 CTC（≥1% 的细胞）与不良预后和生存相关[31]，ICI 治疗 6 个月后CTC上 PD-L1 的持续存在可能代表肿瘤逃逸的发生，从而导致疾病进展。一些研究[32]对CTC的PD-L1表达和组织中PD-L1表达之间的一致性进行了评估，但结果存在争议，需要进一步研究标准化的方法和 PD-L1 抗体来检测和分析 CTC。

3.3.2   循环游离DNA

循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）是目前临床实践中最具潜力的生物标志物，其半衰期较短，约为2 h，可以快速评估肿瘤相关变化，并能够实时监测反应或复发。据文献[33]报道，cfDNA含量的变化是评估接受抗 PD-1 药物治疗患者的肿瘤反应的重要工具。Giroux Leprieur等[34]首次评估ICI反应时（2个月时）的低 cfDNA 含量患者与纳武单抗（nivolumab）的长期获益有关。同时也有研究[35]发现cfDNA 含量的降低可能与对免疫疗法的疗效息息相关，表明 cfDNA 含量可能是治疗效果评估的早期生物标志物，并能预测接受ICI治疗的NSCLC患者的生存期是否有可能延长。在另一项研究[36]中，接受纳武单抗治疗且cfDNA 低于中值（3 mL血浆中836.5 ng） NSCLC 患者的存活时间明显长于cfDNA 值高于中值的患者。此外，cfDNA和CTC的联合分析有助于区分可能在继续使用纳武单抗中受益的低风险人群。这表明，联合使用cfDNA和CTC可以帮助选择从免疫治疗中获益最多的患者。

3.3.3   中性粒细胞/淋巴细胞比值

许多研究[37]报道免疫疗法与中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）之间的相关性。NLR可视为对不同压力刺激的免疫反应的标志物，有研究者[38]发现在接受 ICI 治疗的 NSCLC患者中，高 NLR 值与较短的无进展生存期和总生存期相关。近来一项针对 NSCLC 患者的研究[39]发现，NLR与人类白细胞DR抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）单核细胞和树突状细胞的 ICI 反应之间可能关联。在使用 ICI 后，NLR和 HLA-DR 单核细胞频率降低以及树突状细胞增加，对ICI的反应和更长的总体生存期有预测作用。虽然NLR很容易从常规血细胞计数中评估并且是可重复的，但仍需等待具有临床意义的阈值以进行前瞻性验证。

3.3.4   外泌体

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是纳米尺寸的颗粒，可以由任何细胞类型（包括癌细胞）释放。EV最常见的亚型是外泌体，其表面表达蛋白质并含有多种颗粒，例如核酸和脂质等[40]。肿瘤来源的外泌体同时携带免疫抑制和免疫刺激介质，并可能参与各种免疫调节作用，它保留了部分肿瘤母体细胞的特征[41]，因此，外泌体也是分析预后、预测治疗反应的一种有前景的生物标志物。一项针对 NSCLC 患者的研究[42]发现，外泌体中的 PD-L1 表达与疾病进展、肿瘤大小、淋巴结状态、转移和TNM分期相关。然而，外泌体和组织中的 PD-L1 表达之间没有关联。总之识别肿瘤来源的外泌体并了解其对肿瘤发生和免疫治疗反应的贡献以及其分离方法的标准化仍面临挑战。

3.4   影像组学

影像学研究是非侵入性的，几乎所有癌症患者在他们的诊断和治疗过程中都会接受影像检查，这使得这些类型的数据更加普遍，更重要的是影像学研究可以分析肿瘤的完整空间结构，从而避免穿刺活检取样的限制[43]。影像组学[44]作为人工智能时代的产物，能够高通量地提取肺部图像的定量特征，挖掘肿瘤的生物学信息[45]。这些新方法可以对肺癌病史的不同方面以及阶段进行评估，能够区分癌症的组织学亚型，特别是腺癌和鳞状细胞癌，预测EGFR突变状态或PD-L1 表达以进行NSCLC 患者的风险分层，从而预测对不同类型疗法的反应[46]。Jiang等[47]的研究探讨了18F-FDG PET/CT图像中影像组学特征在评估399个NSCLC中不同PD-L1突变状态的潜在价值，包含来自CT、PET和PET/CT图像的影像组学特征的模型分别计算出受试者工作特征曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.97、0.61和0.97，说明基于影像组学的预测方法，特别是CT衍生的预测模型，可以相对准确地预测NSCLC患者的PD-L1表达状态。Valentinuzzi等[48]创建了一个影像组学特征（iRADIOMICS），与临床标准（iRECIST和PD-L1免疫组织化学）相比，能够预测转移性NSCLC（Ⅳ期）对帕博利珠单抗的反应。共有30例接受帕博利珠单抗治疗的患者在基线、第1个月和第4个月接受18F-FDG PET/CT扫描，多变量基线iRADIOMICS在AUC、准确性预测能力方面均优于当前标准。

近年来，在肺癌高发生率、高死亡率的背景下，转化医学的显著进步使人们更好地了解肿瘤发展背后的机制以及与TME的相互作用。关于ICI 治疗方案的实施以及更加精准预测ICI 反应的多变量平台的创建，依然面临考验。尽管如此，多学科合作，包括肿瘤学、病理学、遗传学、核医学以及生物医学工程，是开发组织中循环和体内生物标志物综合评估的关键。这种合作有望提高我们对ICI反应的预测能力，从而更精准地选择患者，为他们提供个性化的免疫治疗方案。

目前尚无关于此主题的文献可视化分析，本研究首次使用CiteSpace软件对WoS核心合集中有关预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物研究文献进行系统分析，发现2017—2021年该领域发文量呈稳步增加趋势，有越来越多的期刊发表该领域的研究文献，体现该领域研究受到越来越多的青睐。研究热点关键词为PD-L1表达、TMB、EGFR、TME、循环肿瘤DNA、液体活检、CD8+ T细胞、18F-FDG PET/CT、生物信息学、影像组学等。

随着分析技术的持续发展，对敏感性、预后价值更高的免疫治疗生物标志物研究的逐渐重视，研究者们对TME及CTC、cfDNA等对免疫治疗的影响有了更充分认识。未来将多种生物标志物联合起来，对NSCLC患者体内淋巴细胞的免疫状态以及病灶特征等肿瘤相关信息进行更加精准的评估可能是该领域研究的热点及前沿，从而为患者提供个性化的治疗方案，包括药物的种类、治疗方式的选择等方面，切实提高患者免疫治疗的预后。

综上所述，本研究通过对WoS核心合集中有关预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物研究文献进行系统分析，初步呈现了近5年该领域的研究动态，预测了未来可能的研究热点与前沿，希望能够为国内该领域学者的研究提供一定参考。

利益冲突：无。

作者贡献：史宏灿负责课题研究设计及文章指导；孙飞、单一波收集文献资料；卢毅、朱剑炜分析处理数据；袁磊、沈志明负责综合整理及文章撰写。