Nature Genetics：单细胞多组学揭示高危神经母细胞瘤化疗后的微环境重塑

神经母细胞瘤是一种源自神经嵴细胞的儿童实体肿瘤，通常发生于5岁以下的儿童，在生物学上有高异质性的特点，不同的类别往往提示不同的预后。临床上按风险类别可将其划分为低危、中危及高危三个等级，中低危神经母细胞瘤通常有较好的预后，而高危神经母细胞瘤具有高度侵袭性，现有治疗手段下的五年生存率仍低于50%。肿瘤微环境与异质性获得性耐药可以解释这些预后差异。

表观遗传学分析已鉴定出两种不同的神经母细胞瘤分子表型，肾上腺素样（ADRN）及间质样（MES）。ADRN提示肿瘤细胞分化程度较高且对化疗敏感，而MES则代表肿瘤低分化、易耐药与易转移。此外，单细胞转录组学的发展有助于描述肿瘤细胞内在的异质性，并解析肿瘤微环境中的细胞互作关系，为理解肿瘤的侵袭转移及治疗对微环境的重塑提供了新视角。然而，神经母细胞瘤与其免疫表型间的作用关系及耐药机制仍不清楚。

近日，费城儿童医院的 Kai Tan 团队在 Nature Genetics 发表了题为 Longitudinal single-cell multiomic atlas of high-risk neuroblastoma reveals chemotherapy-induced tumor microenvironment rewiring 的文章，通过snRNA、snATAC以及WGS测序解析化疗对高危神经母细胞瘤微环境的影响，着重分析了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）对治疗的应答及其与肿瘤细胞的相互作用，并鉴定出HB-EGF（Heparin-binding EGF-like growth factor）作为促进肿瘤增值与耐药的关键分子，为研究神经母细胞瘤耐药的分子机制提供了方向。

作者团队使用了22例高危神经母细胞瘤样本，将来自同一患者的活检样本与诱导化疗后手术切除的样本配对，通过snRNA、snATAC和WGS进行分析，分别从snRNA-seq和snATAC-seq中获得了372,619个和144,366个高质量细胞，经过注释得到8种主要细胞群（神经母细胞、成纤维细胞、Schwan细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T 细胞和 B 细胞），排除了3种组织特异性细胞群（肝细胞、肾上腺皮质细胞和肾细胞）。初步发现成纤维细胞及巨噬细胞在治疗后的样本中增加。

图1: snRNA-seq和snATAC-seq初步分析结果，按细胞类型注释得到UMAP图（c），各种细胞在治疗前后的分布比例（e），snRNA-seq数据中患者治疗前后的细胞类型比例变化（f）。

接下来，作者分析了肿瘤细胞的状态，以此解析肿瘤细胞内在的异质性。结合来自WGS 数据与snRNA-seq数据的拷贝数变异(CNV) 谱识别肿瘤细胞，共鉴定出205253个肿瘤细胞。将这些肿瘤细胞重新整合聚类后，划分出6种不同状态的肿瘤细胞，从分子表型的角度注释出4个ADRN高簇、1个MES高簇，以及1个兼具中等ADRN和MES特征的中等簇（Interm-OXPHOS）；ADRN高簇又可进一步划分为ADRN-钙、ADRN-多巴胺能、ADRN-基线与ADRN-增值这些群体。

随后，作者评估了新定义的肿瘤细胞群体在治疗期间的变化，发现ADRN-基线和ADRN-增殖群体在治疗后降低，而ADRN-钙、ADRN-多巴胺能和Interm-OXPHOS群体在治疗后增加。同时发现，ALK突变患者的ADRN-基线和ADRN-增殖群体的减少幅度明显较小，治疗后MES状态明显下降，提示携带突变的高危患者与其他高危患者不同的肿瘤特征。最后结合临床信息评估了新定义的细胞状态的临床意义。

图2: 对肿瘤细胞进行注释分群，按不同的细胞状态对肿瘤细胞进行评估，KEGG&GO通路富集（d），治疗前后细胞比例变化（e），按ALK突变状态分层的治疗前后细胞比例变化（f），生存分析（g）（h），不同肿瘤细胞状态下对治疗的临床反应（i）。

在定义了肿瘤细胞特征状态后，作者使用snATAC-seq数据进一步探究了这些细胞状态的转录调控，鉴定出11个表观遗传簇并构建转录调控网络。结果显示，AP-1（activator protein-1）编码基因及其靶标在治疗后上调，提示治疗后MES表型上调。同时还发现，ADRN-增殖这一临床不利的群体在治疗后减少，但表征其状态的基因仍保持表型，初步解释了神经母细胞瘤难治性及耐药性的可能机制。

为进一步分析高危神经母细胞瘤的耐药机制，作者对TAM这一在微环境中最丰富的免疫成分进行了分析。通过对来自snRNA-seq的TAM数据的整合聚类，划分出8个TAM亚群，基于细胞状态鉴定出7种不同的细胞群（增殖、促炎、促血管生成、免疫抑制、组织驻留、脂质相关及未定义状态），并在治疗前后的样本中观察到这些细胞状态的显著变化。其中仅有IL-18⁺促炎状态群体在治疗后减少，提示IL-18⁺巨噬细胞可能与更好的预后相关。

随后，作者使用CytoTalk对TAM与肿瘤细胞的相互作用进行了分析，预测了二者之间的配体-受体相互作用。结果显示这些相互作用涉及促进细胞粘附、细胞迁移及血管生成的分子，其中表皮生长因子家族 (ErbB) 受体（ERBB4和EGFR）与多种配体之间的相互作用最为常见。对这些相互作用的验证则使用了38种抗体组对石蜡包埋样本的索引(CODEX) 空间蛋白质组学共检测，从中鉴别出3种肾上腺素能神经母细胞亚群，ISL1 高群体(ADRN-like-1)、PPP2R2C高群体(ADRN-like-2)和PHOX2B表达最低的群体 (ADRN-like-3)。

回到对表皮生长因子通路的关注，作者发现ERBB4受体在ADRN-like-2神经母细胞中呈现高表达，ERBB4配体HB-EGF和TGFA在ADRN-like-2神经母细胞周围呈现高密度，且这一细胞群体在空间上更靠近巨噬细胞，提示巨噬细胞诱导的ErbB信号传导可能为促进肾上腺素能肿瘤细胞增殖的潜在机制。

图4: 对TAM进行分群注释及进一步分析，得到7种不同的TAM状态细胞群，分析了这些细胞群在治疗前后的分布（d），预测了TAM与肿瘤细胞的相互作用（e），CODEX空间蛋白质组学共检测（g）（h）。

随后，作者构建了小鼠神经母细胞瘤模型，并使用Xenium空间转录组学技术对肿瘤进行检测，在体内水平进一步探究了TAM与肿瘤细胞的相互作用关系。在小鼠模型上验证了此前鉴定的多种细胞表型，并通过空间配体-受体分析验证了预测的相互作用，初步证明了人类神经母细胞瘤微环境的关键表型也存在于小鼠模型中。

图5: Xenium技术验证神经母细胞瘤表型。

基于得到验证的配体-受体相互作用，作者假设在ADRN肿瘤状态下，TAM通过激活ErbB受体酪氨酸激酶导致细胞增殖及耐药性，且由于HB-EGF在治疗后普遍呈现高表达，作者推断HB-EGF与ErbB通路具有一定的协调作用。通过细胞实验将5种神经母细胞瘤细胞系与THP-1巨噬细胞共培养后得出，共培养使得THP-1巨噬细胞表达HB-EGF增加。对共培养的上清液进行ELIZA得出，THP-1巨噬细胞仅分泌HB-EGF配体，这一发现支持HB-EGF为活性配体。此外，共培养的神经母细胞瘤细胞的ERBB4受体磷酸化显著增加，提示HB-EGF / ERBB4信号可能介导神经母细胞瘤细胞与TAM的相互作用。随后，作者使用3种神经母细胞瘤细胞系进行共培养和单培养，确定共培养的巨噬细胞产生的HB-EGF激活了下游信号ERK，推测ErbB信号通过RAS–RAF–MEK–ERK通路调节细胞的活动，且ErbB通路有助于肿瘤细胞存活。为了评估TAM与肿瘤细胞的相互作用对肿瘤细胞表型的影响，作者对共培养的神经母细胞瘤细胞系进行了scRNA测序。结果显示共培养后，肿瘤细胞发生的改变与经历标准治疗后类似，而加入HB-EGF抑制剂CRM197后这一进程被改变。

图7: 单培养/共培养的神经母细胞瘤细胞与巨噬细胞，显示不同的细胞状态比例与通路富集信息。

综上，本研究通过对患者匹配的高危神经母细胞瘤样本的单细胞多组学分析，揭示了诱导化疗导致的肿瘤微环境变化。同时对肿瘤相关巨噬细胞这一群体进行深入研究，鉴定出与肿瘤细胞相互作用的关键分子及通路，并在体内与体外层面对这一通路的真实性进行了验证，初步证明了肿瘤细胞诱导巨噬细胞分泌HB-EGF，进而通过激活ERK通路促进神经母细胞增殖，揭示了神经母细胞瘤可能的耐药机制，为后续研究提供了参考。