厦大朱锦锋/解放军总医院李伯安团队《ACS Nano》：联合开发肝细胞癌细胞外囊泡的快速智能检测技术

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要威胁之一，延迟诊断严重影响患者预后。液体活检技术利用小细胞外囊泡（EVs）为癌症早期检测提供了新可能，但现有方法通常耗时较长、设备复杂，限制了其临床广泛应用。近日，厦门大学与中国人民解放军总医院联合开发出一项名为 MetaEVchip 的检测平台，该平台基于等离激元超表面与 Kolmogorov-Arnold 网络（KAN）人工智能算法集成，能够动态监测 HCC 特异性细胞外囊泡，实现快速检测与纯化，全程仅需 5 分钟即可输出结果。

动态监测与等离激元超表面技术

MetaEVchip 利用纳米结构等离激元芯片实时捕获肝癌来源的小细胞外囊泡（HCC-EVs），并通过多标记抗体混合物实现精准捕获与可控释放。结合 KAN 深度学习算法对动态共振信号进行分析，可在 5 分钟内完成定量检测。该系统优化了 EVs 的纯化流程，并整合了甲胎蛋白（AFP）和异常凝血酶原（PIVKA-II）的联合检测，在外部验证集中显示出高达 0.961 的 AUC 值，能有效区分肝癌与良性肝病，以及早期肝癌与肝硬化，突破了传统 EV 检测技术的局限，展现出在快速癌症筛查中的应用潜力。

MetaEVchip 推动肝癌快速筛查进入新阶段

近期，厦门大学电磁声学研究院朱锦锋教授团队与中国人民解放军总医院第五医学中心李伯安主任团队合作，开发出 MetaEVchip 系统。该系统融合等离激元超表面纳米结构、微流控技术与深度学习，可在 5 分钟内快速检测 HCC-EVs，为临床及时诊断提供有力支持。该方法还能纯化 HCC-EVs，用于下游蛋白质特征分析，从而更好地区分肝癌与良性肝病。该研究成果以题为《Rapid Detection and Purification of Extracellular Vesicles for Hepatocellular Carcinoma Screening Using a Plasmonic Metasurface Integrated with the Kolmogorov−Arnold Network》发表于国际权威期刊 ACS Nano。厦门大学朱锦锋教授、宋彦龄教授，解放军总医院李伯安主任、李波主任为论文共同通讯作者；朱锦锋团队的博士生朱嘉恒，硕士生黄添豪、曾丽煌，李伯安团队的硕士生王辰洪妹四人为论文的共同第一作者。

【文章要点】

在这项研究中，作者开发了实时HCC-EVs纯化系统，整合了三个关键因素：（1）用于实时HCC-EVs捕获监测的等离激元超表面生物芯片，（2）用于HCC-EVs捕获和释放的多标记抗体混合物，以及（3）用于5分钟内快速HCC-EV浓度检测的KAN深度学习方法。其中，周期性纳米孔阵列利用等离激元效应实现表面折射率变化的高灵敏检测。与传统等离激元生物传感器不同，该平台引入了动态监测方法，实时跟踪HCC-EVs结合事件期间的共振波长移位。这种动态传感模式与微流控集成，创建了一个智能系统，能够在线优化HCC-EVs捕获和纯化过程。实时反馈机制显著提高了HCC-EVs纯化的效率和精度，同时与标准临床工作流程兼容。此外，注入甘氨酸促进HCC-EVs从微流控中的快速释放，允许与下游临床测定兼容，用于定量检测这些HCC-EVs中的AFP和PIVKAII，完成全面的“小EV表面到内容”分析工作流程。

如图1所示，作者首先展示了MetaEVchip及其操作机制。芯片具有功能化的周期性纳米孔，针对三种HCC特异性表面标记物：EpCAM、ASGPR和GPC3的抗体混合物。随着血清样本流经MetaEVchip，抗体选择性地捕获小EVs，并通过观察共振移位实时监测该过程。使用KAN深度学习神经网络在5分钟内检测HCC特异性EVs的浓度。SEM图像显示了MetaEVchip纳米孔结构的顶视图和侧视图。生物功能化过程后是小EVs的捕获及其后续纯化，整个过程包括HCC-EVs结合和释放期间共振移位的实时监测。

图1 MetaEVchip及其操作机制

为了验证MetaEVchip的生物传感基础，作者进行了光学模拟和测量。图2显示了MetaEVchip集成到微流控芯片中，通过光纤实时监测信号响应。测量的反射光谱与光学模拟密切匹配，插图显示了在正常入射下水中等离激元共振的电场分布，表面区域有显著的近场增强，增强高达30倍。当通过特定抗体介导的小EV结合发生在纳米孔附近时，共振红移。这种红移与结合的小EV数量相关。通过甘氨酸洗脱，共振波长返回到其原始位置。动态实时监测显示，ASGPR-based、EpCAM-based和GPC3-based metaEVchip的结合特异性测试符合Langmuir定律，确认仅在小EV检测事件中发生超表面等离激元共振偏移。

图2 MetaEVchip生物传感的基础分析

进一步优化MetaEVchip捕获和纯化标准小EV样本。如图3所示，实验传感曲线显示了MetaEVchip的线性检测范围为1×10⁵至1×10⁸ particles/mL。在30 μL/min的流速下，三种抗体（anti-EpCAM、anti-ASGPR和anti-GPC3）的组合提供了比单一抗体优越的HCC特异性小EVs捕获。甘氨酸pH为2时，纯化效率最佳，共振波长返回原始位置。回收实验显示，在动态实时监测下，HCC特异性小EV捕获和纯化效率一致，回收率在五个周期中保持约70%。

图3 优化MetaEVchip捕获和纯化

KAN赋能MetaEVchip动态监测实现5分钟快速小EV检测。如图4所示，动态监测不同浓度的游离蛋白对最终共振移位无明显影响。但在不同浓度梯度的小EVs捕获过程中，初始5分钟的捕获速率遵循浓度依赖性动力学，符合Langmuir吸附模型。KAN神经网络架构用于5分钟快速小EV检测，与MLP、Transformer和CNN模型相比，KAN的学习曲线显示最小损失（≈1.18×10^-2），网络参数更少。混淆矩阵显示KAN在整个波长移位范围内实现了100%的预测准确性，显著缩短了metaEVchip的诊断时间至5分钟。

图4 KAN赋能MetaEVchip动态监测

MetaEVchip的5分钟快速测定结果与血清蛋白测定对比。如图5所示，HCC-EVs纯化工作流程后，通过NTA显示纯化HCC特异性小EVs的颗粒大小分布，平均大小约105 nm，TEM确认了完整的形态。热图表达显示四个数据集：metaEVchip 5分钟测定结果、纯化HCC-EVs的蛋白结果、直接血清测定结果。队列包括晚期HCC患者（n=47）、早期HCC患者（n=45）、肝硬化患者（n=45）和肝炎患者（n=45）。MetaEVchip的5分钟快速检测与纯化HCC-EVs的NTA显示出优秀的一致性，HCC信号强度高于肝硬化和肝炎队列。Student’s t-test分析显示HCC-EVs检测、AFP和PIVKAII蛋白测定在队列间有统计学显著差异，基于EVs测定比直接血清测定显示出更好的区分度。

图5 实时MetaEVchip 5分钟快速测定结果

MetaEVchip的临床性能评估。如图6所示，PIVKAII和AFP在区分HCC与BLD以及早期HCC与肝硬化的ROC-AUC显示出高诊断性能。相关矩阵显示五个HCC相关生物标志物对的关联。PCA可视化分类早期HCC与肝硬化的HCC相关指标分析数据。基于KAN深度学习多指标诊断筛查HCC，平均准确性和AUC随生物标志物数量增加而提高。在外部验证集中，结合KAN和多个指标的ROC曲线显示HCC筛查的诊断能力，AUC为0.961。校准曲线和单生物标志物在KAN算法中的相对重要性分数进一步确认了该方法的可靠性。

图6 基于MetaEVchip的HCC特异性小EVs纯化系统的临床性能

【结论与展望】

论文最后指出，HCC是一种严重的疾病，其预后较差，主要由于晚期诊断。近期研究表明，基于小EVs的液体活检在癌症筛查中具有潜力。该工作表明，metaEVchip平台通过动态传感、微流控处理和人工智能的整合，提供了一种用于HCC筛查的综合方法，具有跨多种疾病状态的潜在效用。此外，这些发现支持了改进EVs检测作为治疗HCC的潜在策略的可能性。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.5c11740