青岛大学附属医院/崂山实验室：功能性温敏水凝胶调控免疫微环境与干细胞分化，协同促进软骨再生

深度解析医学证据，DeepEvidence为你支撑决策

背景介绍

骨关节炎是一种以软骨退化、软骨下骨重塑和慢性炎症为特征的异质性关节疾病，全球约7%的人口受其影响。由于关节软骨无血管、无神经且自我修复能力极低，现有治疗手段（如止痛药、抗炎药乃至关节置换）多为姑息性，无法实现真正意义上的软骨再生。近年来，基于干细胞或祖细胞来源的外泌体的无细胞疗法以及具有免疫调节功能的生物活性离子受到广泛关注，但单一疗法难以应对软骨损伤的多因素病理过程。因此，开发能够协同调控炎症微环境、募集内源干细胞并诱导其成软骨分化的多功能水凝胶平台具有重要意义。

研究思路

针对上述挑战，青岛大学附属医院张英泽教授、王天瑞教授与崂山实验室唐波教授、毕世超教授联合团队，设计了一种基于羟丁基壳聚糖（HBC）的温敏可注射水凝胶，共载锶离子（Sr）和软骨祖细胞来源的外泌体（CPC-EXOs），命名为HBC@Sr@CPC-EXOs。该水凝胶在体温下自发成胶，且利用Sr（快速释放，36 h释放约50%）和CPC-EXOs（60 h释放约50%）的时序释放动力学，实现了“先抗炎、后修复”的功能衔接：Sr在早期（0-12 h）迅速抑制促炎因子（TNF-α、PGE2、NO）并诱导巨噬细胞向M2型极化；CPC-EXOs在晚期（24-48 h）持续驱动免疫重编程并激活TGF-β1/Smad2/3信号通路，同时抑制Notch通路，从而促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成软骨分化。体外实验证实该水凝胶能显著增强软骨细胞活力和基质合成，并抑制分解代谢酶（MMP-13、ADAMTS5）。在大鼠股骨髁骨软骨缺损模型中，HBC@Sr@CPC-EXOs在6周和12周时均表现出最平滑的关节表面、最高的ICRS评分、最丰富的糖胺聚糖和II型胶原沉积，以及最佳的软骨下骨重建（BV/TV显著高于对照组）。相关内容以Functionalized Thermosensitive Hydrogel Regulates the Immune Microenvironment and Stem Cell Differentiation to Enhance Cartilage Regeneration发表在ACS Nano上！

图片解析

图1：设计思路图

图2：分离的软骨祖细胞（CPCs）高表达CD29、CD44、CD90，低表达CD45、CD34；其外泌体呈典型囊泡形态（TEM），直径100-200 nm（NTA），表达CD81、CD63、TSG101；PKH26标记的外泌体可被软骨细胞和BMSCs有效摄取。

图3：¹H NMR和FTIR证实羟丁基成功接枝到壳聚糖上，取代度1.28；HBC溶液在4℃为溶胶，37℃成胶（可逆）；流变学显示含Sr的水凝胶储能模量显著提高；SEM展示三维蜂窝状结构，EDS证实Sr均匀分布。

图4：HBC@Sr@CPC-EXOs在IL-1β刺激下显著提高软骨细胞活力（CCK-8），降低死细胞比例（活/死染色），下调iNOS、MMP-13、ADAMTS5的mRNA和蛋白水平，并抑制NO、PGE2、TNF-α释放。

图5：在LPS+IFN-γ诱导的THP-1巨噬细胞中，含Sr的组在0-12 h窗口显著抑制NO和M1标志物（CD86、iNOS）；含CPC-EXOs的组在24-48 h窗口显著上调M2标志物（CD206、Arg-1）和IL-10，证明时序免疫调节。

图6：HBC@Sr@CPC-EXOs促进BMSCs迁移（划痕、Transwell），增强成软骨分化（阿利新蓝/甲苯胺蓝染色），上调SOX9、ACAN、COL2A1基因和蛋白表达。

图7：RNA-seq显示HBC@Sr@CPC-EXOs富集TGF-β信号通路，抑制Notch信号通路；Western blot证实p-Smad2/3升高、NICD降低，免疫荧光显示Smad2/3核转位增加；相关性分析表明p-Smad3与软骨标志物正相关（R²=0.81-0.99），NICD负相关。

图8：大鼠骨软骨缺损模型中，HBC@Sr@CPC-EXOs在6周和12周时ICRS评分最高，血清TNF-α最低、IL-10和TGF-β1最高；micro-CT显示BV/TV显著提升，骨小梁连续性最佳。

图9：H&E和番红O/固绿染色显示HBC@Sr@CPC-EXOs组修复组织最接近正常软骨，GAG和COL2免疫组化最强，MMP-13表达最低；水凝胶在8周时降解约70%。

结论

本研究成功构建了一种基于羟丁基壳聚糖的温敏多功能水凝胶HBC@Sr@CPC-EXOs，通过Sr的早期抗炎和CPC-EXOs的晚期免疫重编程及成软骨诱导，实现了对骨关节炎微环境的时序调控。该水凝胶在体外能有效保护软骨细胞、促进BMSCs迁移和成软骨分化，在大鼠骨软骨缺损模型中显著促进了关节表面修复、软骨下骨重建和基质合成，且具有良好的生物相容性。该策略为骨关节炎和软骨缺损的治疗提供了一种集成免疫调节、干细胞募集和软骨诱导于一体的新平台。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.6c00315