Genome Medicine：突破诊断局限！短读长基因组测序覆盖多类变异，助力罕见病 “一测全包”

罕见疾病作为一类复杂性高、治疗选择有限且诊断成本高昂的疾病，对全球公共卫生系统构成了显著负担，在西方人群中约有3.5%至5.9%的个体受到6000至10000种不同罕见疾病的影响，其中超过80%的病例被认为具有遗传起源。目前，传统的诊断方法组合包括核型分析、阵列比较基因组杂交和外显子测序，这些共同构成了罕见病遗传检测的标准护理流程，尽管这些方法在联合使用时能够覆盖一定范围的分子诊断，但它们存在耗时较长、分辨率有限等固有缺陷，尤其在检测非编码变异、较小结构变异和复杂基因组重排方面表现不足。短读长基因组测序作为一种全面的遗传检测技术，能够在一个单一检测中识别单核苷酸变异、拷贝数变异、线粒体变异、重复扩展和结构变异，从而提供了克服传统方法局限性的潜力，近年来研究显示基因组测序在诊断转诊病例中检测率高达95%，表明其可能成为一种高效的统一诊断工具。然而，在真实世界临床环境中，关于基因组测序作为一线测试的大规模前瞻性研究仍然稀缺，且尚未全面评估所有潜在框架，因此本研究旨在通过直接比较单重基因组测序、三重基因组测序和标准护理在罕见病诊断中的表现，验证短读长基因组测序是否能够真正成为罕见病病例的“一测全包”策略。

本研究采用了一项前瞻性、盲法设计，在2022年1月至2023年4月期间，从德国石勒苏益格-荷尔斯泰因大学医院招募了416名符合预定义标准的罕见病患者及其家属，最终包括1011个基因组，其中335个为三重病例（涉及多个家庭成员）和81个单重病例。所有参与者在提供知情同意后，同时接受了标准护理测试和短读长基因组测序，标准护理测试根据疾病类别包括核型分析、阵列比较基因组杂交和外显子测序的序贯分析，而基因组测序则使用Illumina NovaSeq 6000平台进行，平均覆盖深度为38倍。研究设置了三个独立分析团队：标准护理团队由经验丰富的诊断专家组成，负责基于表型指征分析核型、阵列比较基因组杂交和外显子测序数据；单重基因组测序团队由新培训的分析师组成，仅使用索引患者的基因组测序数据；三重基因组测序团队同样为新培训人员，但分析索引患者及其父母或兄弟姐妹的基因组测序数据。

每个团队在不知晓其他团队结果的情况下，独立记录候选变异，并由一个协作评估委员会最终确定诊断结果。研究分为两个阶段：前瞻性阶段评估各团队在实际操作中的诊断能力，而回顾性阶段则在统一条件下重新评估所有数据，以消除经验差异的影响，纯粹比较策略的技术检测能力。变异检测使用DRAGEN生物信息学平台进行，包括单核苷酸变异、拷贝数变异和短串联重复的识别，并通过TruSight软件套件或Alissa Interpret进行解释，变异分类遵循美国医学遗传学与基因组学学院和分子病理学协会的指南，将结果分为致病性或可能致病性变异、意义不确定变异和无发现类别。统计分析采用Cochran's Q检验和McNemar's检验比较诊断率，并使用滑动窗口分析（窗口大小为25例）来追踪各团队的学习曲线和性能优化过程，确保数据评估的客观性和可重复性。

在前瞻性分析中，针对335例三重病例，三重基因组测序团队在致病性或可能致病性变异方面的诊断率最高，达到36.1%，而标准护理团队和单重基因组测序团队分别为35.1%和28.8%，当包括意义不确定变异时，标准护理、单重基因组测序和三重基因组测序的总诊断率分别增至46.4%、34.6%和42.5%。在81例单重病例中，标准护理和单重基因组测序在前瞻性评估中诊断率相近，分别为35.8%和32.7%。为了排除经验因素影响，回顾性分析显示，三重基因组测序的诊断率进一步提升至40.0%，单重基因组测序为39.1%，标准护理为36.7%，且意义不确定变异比例在所有策略中一致为11.6%。统计检验证实，在回顾性数据中，三重基因组测序和单重基因组测序均显著优于标准护理，绝对差异分别为3.3%和2.4%，达到了预定义的临床意义阈值。

图1 研究设计和队列概述

基因组测序策略的优越性主要体现在其能够检测标准护理遗漏的独特变异类型，包括深内含子变异、非编码变异、小拷贝数变异和短串联重复，例如研究通过基因组测序识别了三个最初缺乏基因-疾病关联的de novo变异，后续通过GeneMatcher合作或新发表研究升级为可能致病性；此外，还检测到两个内含子至内含子的拷贝数缺失、三个短串联重复扩展（如DMPK基因中的CAG重复扩展）和一个非编码变异，这些发现凸显了基因组测序在全面变异筛查中的优势。

在遗传模式方面，对115例三重病例的分析显示，55.1%的致病性变异为de novo继承，17.7%为母系或父系遗传的杂合变异，15.2%为双亲复合杂合，10.9%为双亲纯合，2.2%为母系半合子。就变异类型而言，在181个致病性或可能致病性变异中，单核苷酸变异最为常见，其中错义变异占39.8%，功能丧失变异占33.7%，拷贝数变异占18.8%，剪接区变异占4.4%，内含子或非编码变异占1.7%，短串联重复也占1.7%。按疾病类别划分，综合征病例的诊断率最高，回顾性分析中达62.5%，而神经发育障碍伴自闭症的病例诊断率较低，仅为27.8%。此外，2.4%的索引患者在ACMG次要发现列表基因中检出可操作变异，而父母和兄弟姐妹中的检出率为1.8%。学习曲线分析表明，单重基因组测序团队初始诊断率较低（10%），但通过持续优化和培训，在205例后与其他团队性能相当，反映了经验积累对诊断效果的重要影响；错误分类分析显示，基因组测序策略中约50%的漏诊归因于经验相关因素，而标准护理团队的漏诊主要由于技术限制。

图2 三种分析策略的前瞻性工作流程和诊断率

综上，本研究通过前瞻性真实世界数据证实，短读长基因组测序，尤其是三重基因组测序，在罕见病诊断中优于传统标准护理方法，能够提供更高的诊断率并检测更广泛的变异类型。三重基因组测序不仅通过继承数据促进了变异的准确分类，还使经验较少的团队能够达到与经验丰富团队相当的诊断水平，从而加速诊断过程并减少患者诊断旅程。单重基因组测序作为一种成本效益较高的替代方案，在经验丰富的团队中表现接近三重基因组测序，但在缺乏父母数据时可能导致更多意义不确定变异的报告。总体而言，基因组测序作为一种统一的一线测试策略，具有显著潜力整合到常规诊断流程中，以提升罕见病分子诊断的效率和全面性，未来结合多组学数据和长读长测序可能进一步解决基因组测序在复杂区域解析中的局限，优化临床应用。

原始出处：

Kaschta, D., Post, C., Gaass, F. et al. Evaluating genome sequencing strategies: trio, singleton, and standard testing in rare disease diagnosis. Genome Med 17, 100 (2025). https://doi.org/10.1186/s13073-025-01516-7

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