国立清华大学《自然·通讯》：工程化人类PEG10纳米颗粒实现RNA自包装、递送与癌症治疗

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背景介绍

mRNA therapeutics在COVID-19疫苗成功及数百项临床试验的推动下，已成为疫苗、疾病治疗和癌症治疗的前沿领域。然而，成本效益高的mRNA生产、高效的包装以及特异性靶向递送仍面临重大挑战。现有非病毒载体如脂质纳米颗粒、胞外囊泡和病毒样颗粒各具局限性，包括制造工艺复杂、货物控制能力有限、靶向性欠佳及安全性问题。近期发现的人源PEG10蛋白可自组装成纳米颗粒，并优先结合自身mRNA的5'和3'非翻译区，从而实现mRNA的自包装。但该系统的产量低（依赖三质粒共转染）、成本高，且尚未被探索用于癌症治疗。

研究思路

针对上述挑战，国立清华大学化学工程系的胡育诚教授团队开发了一种基于杆状病毒的高效生产平台，用于生产人PEG10纳米颗粒。通过构建重组杆状病毒共转导HEK293T细胞，PBNPs的产量较质粒转染提高了11.3倍，且成本显著降低。PBNPs能够自包装长达7336个核苷酸的mRNA，并在4°C下稳定保存7个月。通过将EGFR特异性单链抗体融合至VSVG蛋白N端，工程化PBNPs（ePBNPs）对多种癌细胞的mRNA递送效率大幅提升，在结肠癌细胞中达到约71%。进一步将ePBNPs重编程以自包装IL-12和OX40L的mRNA混合物，转染结肠癌细胞后可在体外引发T细胞应答。在雌性小鼠模型中，ePBNPs联合化疗药物奥沙利铂协同增强了抗肿瘤免疫反应，抑制了肿瘤生长。相关内容以Engineering human PEG10-based nanoparticles for RNA self-packaging, delivery and cancer therapy发表在Nature Communications！

图片解析

图1. 杆状病毒系统生产PBNPs的表征： (a) 用于PBNPs生产的质粒和杆状病毒示意图。(b) 杆状病毒转导生产PBNPs的流程图。(c) 杆状病毒转导与质粒转染的PBNPs功能滴度比较（TU/mL），杆状病毒组提高11.3倍。(d) PBNPs提取RNA的变性凝胶电泳，显示主导条带对应egfp及UTR长度。(e) cDNA及模板质粒的DNA电泳，RT-PCR使用跨越不同区域的引物对。(f) RNA-seq分析蛋白编码转录本相对丰度，egfp mRNA占比36.1%，peg10 mRNA占比18.9%。(g) 生产者细胞裂解液及纯化PBNPs的Western blot，检测PEG10、VSVG、GP64和GAPDH。(h) PBNPs的代表性TEM图像，显示球形颗粒（约100 nm）。

图2. PBNPs的包装容量： (a) 编码不同长度货物的杆状病毒示意图（1720 bp至7336 bp）。(b) qRT-PCR测定不同长度货物的基因组滴度（mRNA拷贝数/μL）。(c) 不同长度货物的功能滴度（TU/mL）。(d) HEK293T细胞转染不同PBNPs后的荧光显微图（EGFP和mCherry）。(e) 流式细胞术定量EGFP⁺和mCherry⁺细胞比例，显示不同长度间无显著差异（p>0.05）。

图3. 工程化PBNPs改善对不同癌细胞的RNA递送： (a) 生产野生型PBNPs和工程化PBNPs的杆状病毒组合，eVSVG为EGFR scFv与VSVG的融合蛋白。(b) Western blot检测PBNPs中eVSVG/VSVG的掺入（抗His₆标签检测eVSVG）。(c) 不同Bac-eVSVG比例下PBNPs的功能滴度。(d) 流式细胞术检测CT26细胞EGFP⁺比例，33% eVSVG比例时效率达71%。(e) 免疫金标TEM显示ePBNPs表面eVSVG展示（金颗粒标记His₆）。(f) PBNPs转染HEK293T及多种癌细胞后的荧光显微图（CT26、U-87、MC38、Hepa1-6、Huh7、Hep3B、4T1）。(g) 流式细胞术定量转染效率，ePBNPs对多种癌细胞效率>60%。

图4. ePBNPs自包装IL-12和OX40L mRNA刺激T细胞应答： (a) 生产ePBNP.OI的杆状病毒示意图。(b) 转染CT26细胞与脾细胞共培养实验流程图。(c) ELISA检测IL-12和OX40L表达动力学，ePBNP.OI组显著高于wtPBNP.OI组。(d) ELISA检测IFN-γ和TNF-α表达，ePBNP.OI组显著升高。(e) 共培养3天后脾细胞增殖图像，ePBNP.OI组增殖最明显。(f) 流式细胞术检测活化CD4⁺和CD8⁺ T细胞百分比，ePBNP.OI组最高。

图5. ePBNPs自包装IL-12和OX40L mRNA体内改善免疫治疗效果： (a) 动物实验方案示意图（CT26皮下肿瘤模型）。(b) 各组肿瘤体积生长曲线（PBS、OXA、ePBNP.OI、Combo）。Combo组5/6小鼠肿瘤受抑，2只完全缓解（CR）。(c) 生存曲线，Combo组第30天生存率100%。(d-e) ELISA检测血清TNF-α和IFN-γ水平，Combo组显著高于其他组。

结论

本研究解决了PEG10 RNA递送平台的两个关键瓶颈：产量和靶向性。通过杆状病毒系统，PBNPs产量提高11.3倍且成本降低；通过EGFR scFv融合VSVG进行表面工程化，ePBNPs对多种癌细胞的mRNA递送效率大幅提升（结肠癌细胞达71%）。ePBNPs能够自包装至少7336 nt的大RNA货物，并在4°C稳定保存7个月。重编程后的ePBNP.OI可同时递送IL-12和OX40L mRNA，在体外激活T细胞应答，体内联合奥沙利铂协同抑制肿瘤生长、提高生存率，且未观察到明显毒性。该平台具有模块化、可规模化、人源化（降低免疫原性）等优势，为mRNA癌症免疫治疗提供了有前景的新型递送载体。