最新Nature子刊：单核测序鉴定中央杏仁核FGFR1为酒精使用障碍治疗靶点

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背景介绍

酒精使用是全球疾病负担的主要贡献因素，但有效的治疗方法仍然有限。只有少数规律饮酒者会发展为成瘾（即酒精使用障碍，AUD），提示酒精成瘾的易感性源于不同个体间尚不完全清楚的生物学机制。酒精成瘾的一个核心诊断标准是尽管面临不良后果仍持续饮酒，即“强迫性”饮酒行为。这种强迫性模式是区分问题性饮酒者与社交饮酒者的关键特征。在大鼠中，个体在惩罚条件下仍坚持酒精自我给药的差异可通过电击惩罚模型进行模拟——只有部分大鼠在酒精输注伴随足部电击时仍维持高水平的操作式反应。此前研究已表明，中央杏仁核（CeA）中PKCδ⁺ GABA能神经元在这种惩罚抵抗性酒精自我给药中发挥因果作用，但其背后的分子机制尚不清楚。

研究思路

针对上述挑战，瑞典林雪平大学Markus Heilig教授团队联合美国德克萨斯大学奥斯汀分校等机构，通过对CeA进行大规模单核RNA测序（snRNA-seq），系统比较了惩罚抵抗型（强迫性饮酒）和惩罚敏感型（非强迫性）雄性和雌性大鼠的转录组特征。加权基因共表达网络分析（WGCNA）在PKCδ⁺神经元中鉴定出一个在惩罚抵抗型大鼠中显著上调的共表达模块，其核心驱动基因之一为成纤维细胞生长因子受体1（Fgfr1）。RNAscope原位杂交验证了Fgfr1在PKCδ⁺神经元中的选择性过表达。利用新构建的PKCδ-Cre大鼠品系，选择性敲低PKCδ⁺神经元中的Fgfr1可降低Prkcd mRNA表达，并特异性地减少惩罚抵抗性（而非无惩罚）酒精自我给药。系统给予FGFR1拮抗剂PD173074可剂量依赖性地复现这一效应。相关内容以 Identification and validation of central amygdala FGFR1 as a therapeutic target for alcohol use disorder using single-nucleus sequencing in rats 发表在 Nature Communications！

图片解析

图1. 行为学模型描述： (A) 实验时间线示意图。(B-C) 惩罚敏感型（蓝色，n=12）和惩罚抵抗型（红色，n=12）大鼠在各行为阶段的酒精自我给药（强化物数量）和酒精摄入量（g/kg），误差线表示SEM。(D) 惩罚抵抗分数在惩罚（强迫性）自我给药过程中的概率密度分布，显示两种不同群体的出现，密度图包含被分类为惩罚敏感型或惩罚抵抗型的大鼠（n=24）。(E) 最后3天平均抵抗分数的直方图显示双峰分布。(F-G) 用于snRNA测序的大鼠在惩罚阶段的抵抗分数和受惩罚酒精奖励数，惩罚抵抗型（红色，n=12）在整个惩罚阶段维持高水平反应（RS~0.46，约18%下降），惩罚敏感型（蓝色，n=12）显著抑制（RS~0.08，约84%下降）。线性混合效应模型显示组的显著主效应（p<0.001）。

图2. CeA细胞类型鉴定与亚聚类： (A) CeA细胞UMAP降维图，根据已知标志物表达标注的细胞类型对应不同聚类，鉴定出少突胶质细胞、谷氨酸能神经元、GABA能神经元、胆碱能神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和少突胶质前体细胞等。(B) CeA中抑制性神经元亚型的UMAP图，标签显示各亚簇的独特标志物。(C) 基因表达层次聚类用于识别抑制性亚簇群组，其中PKCδ⁺神经元被鉴定为GABAergic抑制性神经元的一个独特亚群（亚簇5和18）。

图3. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定差异表达模块： (A) WGCNA分析显示在惩罚抵抗型与惩罚敏感型及yoked对照组比较中，PKCδ⁺神经元（亚簇18）中存在一个显著差异表达的共表达模块（模块8）。(B) 该模块中代表性基因在GABAergic亚簇中的表达分布。(C) 基于连接度（kME）的模块前10位基因列表，Fgfr1被鉴定为核心驱动基因之一。(D) 模块8基因的IPA通路富集分析显示FGFR1信号通路相关下游通路显著富集。

图4. RNAscope验证FGFR1在PKCδ⁺神经元中的表达： RNAscope原位杂交实验证实Fgfr1 mRNA在PKCδ⁺神经元中显著共定位，且在惩罚抵抗型大鼠PKCδ⁺神经元中Fgfr1 mRNA表达显著上调（独立样本t检验，双尾，t(12)=3.38，p=0.0055），表明Fgfr1在强迫性饮酒行为相关神经元群体中特异性高表达。

图5. PKCδ⁺神经元中Fgfr1敲低对惩罚抵抗性酒精自我给药的影响： (A) 实验时间线。(B) 惩罚自我给药训练后，大鼠双侧CeA注射Cre依赖的AAV载体，编码靶向Fgfr1的shRNA（红色）或乱序对照（蓝色）。(C) RNAscope数据证实PKCδ细胞中Fgfr1 mRNA成功敲低（乱序n=10；FGFR1 KD n=10；t(18)=6.70，p=0.000003）。(D) FGFR1敲低组Prkcd mRNA也显著降低（t(18)=2.24，p=0.038）。(E) 各行为阶段酒精自我给药显示，FGFR1敲低特异性减少惩罚抵抗型大鼠的受惩罚酒精自我给药，而不影响无惩罚阶段的酒精操作式反应。

图6. PD173074剂量依赖性地抑制惩罚抵抗性酒精自我给药： (A) 实验时间线（惩罚抵抗型红色n=22，惩罚敏感型蓝色n=15）。(B-C) 各行为阶段酒精自我给药强化物数量和酒精摄入量。(D-E) 系统（腹腔注射）给予选择性FGFR1拮抗剂PD173074剂量依赖性地降低惩罚抵抗型大鼠的抵抗分数（拉丁方设计；重复测量ANOVA显示药物主效应显著，F(1,42)=10.2，p=0.0002；15 mg/kg vs 溶媒，p=0.0002）和受惩罚酒精自我给药（F(1,42)=11.29，p=0.0001；15 mg/kg vs 溶媒，p=0.0002）。(F) PD173074对无惩罚酒精自我给药无显著影响（单因素ANOVA，F(1,27)=1.45，p>0.05），表明其效应特异性地针对强迫性饮酒行为而非一般饮酒动机。

结论

该研究首次将单核RNA测序与细胞类型特异性功能验证相结合，系统鉴定并验证了CeA PKCδ⁺神经元中FGFR1信号在雄性大鼠强迫性酒精使用中的关键驱动作用。其核心创新包括：利用大规模snRNA-seq（72只大鼠，39万余个细胞核）绘制了CeA细胞类型转录组图谱，并在PKCδ⁺神经元中通过WGCNA鉴定出与惩罚抵抗相关的共表达模块，Fgfr1为模块核心驱动基因之一；RNAscope原位杂交证实Fgfr1在PKCδ⁺神经元中特异性高表达且在惩罚抵抗型大鼠中显著上调；利用新构建的PKCδ-Cre大鼠品系进行细胞类型特异性Fgfr1敲低，选择性降低受惩罚酒精自我给药而不影响无惩罚饮酒，证明FGFR1特异性地调控强迫性饮酒维度；系统给予FGFR1拮抗剂PD173074剂量依赖性地抑制惩罚抵抗性酒精自我给药，进一步验证了FGFR1作为药物靶点的可行性；IPA通路分析显示FGFR1下游PI3K/AKT、RAS/MAPK和PLCγ等经典信号通路在差异模块中显著富集，Fgfr1敲低同时降低Prkcd mRNA水平，支持FGFR1通过协调转录程序调控PKCδ⁺神经元活性状态的工作模型。该研究为理解酒精成瘾易感性的细胞类型特异性分子机制提供了重要框架，并将FGFR1定位为酒精使用障碍的潜在治疗靶点。