2014 中国脑胶质瘤分子诊疗指南

中文标题：

2014 中国脑胶质瘤分子诊疗指南

发布机构：

中国脑胶质瘤协作组

发布日期：

2014-05-30

简要介绍：

一、意义和背景制订本指南的目的是建立以循证医学为基础的脑胶质瘤分子检测分析体系，描述最普遍的胶质瘤相关的分子改变、潜在的治疗靶点和生物标志物，从而用于指导临床实践并做出治疗选择。对于哪一个（类）患者或者样本需要进行检测，何时检测和如何检测，本指南中也给出了推荐。 临床实践指南( clinical practice guideline，CPG)，不同于临床随机对照试验，是在特定的临床条件下经过系统的分析后形成的诊疗指南，能够有效地帮助临床医生做出准确的诊断，并选择合适的治疗方案。指南应满足：清晰性、有效性、可靠性、可重复性、应用灵活性、多学科融合、有依据性和可作为指导性。临床实践指南的目标是服务于临床工作，从而改善患者的临床预后，并为医疗教育提供指导，为疗效评估、专业审核提供依据，为合理治疗和建立临床路径提供帮助。 二、前言脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，其中一半以上为恶性度最高的胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。GBM患者即使采用了最为积极的治疗手段，中位生存期仍然少于15个月。近年来，神经肿瘤分子病理取得了重大进展，目前已发现一系列有助于脑胶质瘤临床诊断和预后判断的分子标志物。目前的WHO病理分级仍然依赖形态学进行肿瘤分级，然而，有充分的证据表明，组织特征相同或相似的胶质瘤可以具有不同的分子遗传学背景，导致WHO分级相同的个体间预后有着较大差异。基于肿瘤遗传学水平的分子病理分型能够更准确地判断临床预后；并且对组织学上较难鉴别的混合性胶质瘤（少突星形细胞瘤和间变性少突星形细胞瘤）还能帮助明确诊断和分级。另外，这些新近发现的分子变异有可能成为未来治疗的新靶点。近10年来，尽管脑胶质瘤的基础和临床研究有了较大突破，但是弥漫性胶质瘤患者预后的改善仍然十分缓慢。进一步了解胶质瘤的分子生物学特征，通过临床试验明确更多潜在的分子标志物，有望揭开脑胶质瘤病理生理和发病机制的神秘面纱。除了种族、性别、年龄、生活习惯等临床常见因素，重要的分子标志物的筛选，对临床应用均有深远的意义。指南由资深专家参与拟订，可靠性、实用性强，指南中的分子标志物是治疗的靶点、预测因子或判断预后的指标，也能作为制订行业规范的依据。三、流行病学胶质瘤占所有原发性中枢神经系统肿瘤的32%，占中枢神经系统恶性肿瘤的81%。恶性胶质瘤的发病率为(5 -8)/100万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位。世界卫生组织1998年公布按肿瘤致死率排序，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35 -54岁患者的第3位死亡原因。2012年中国肿瘤登记报告指出中国脑及中枢神经系统恶性肿瘤死亡率为3. 87/10万，位列十大高病死率肿瘤之第9位。以恶性胶质瘤为代表中枢神经系统恶性肿瘤造成了巨大的社会经济及家庭负担，一直是当今肿瘤研究的热点。四、现有的胶质瘤分类系统胶质瘤是指来源于胶质细胞的肿瘤，本指南中特指来源于星形胶质细胞或少突胶质细胞的肿瘤。根据肿瘤生长方式，胶质瘤可以分为两类：局限性胶质瘤（毛细胞型星形细胞瘤）与弥漫性胶质瘤。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类（2007年，第四版），弥漫性胶质瘤可以分为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。病理特征：弥漫性星形细胞瘤（WHOⅡ级）具有大量增生的胶质纤维，伴有轻中度核异型和明显活跃的核分裂象。少突胶质细胞瘤（WHOⅡ级）表现为细胞边界清楚、胞浆透明，有位于细胞中央的圆形细胞核，呈蜂巢样排列。间变性少突胶质细胞瘤（WHOⅢ级）表现为明显的细胞核异型性和血管增生。CBM（多形性胶质母细胞瘤，WHOⅣ级），作为最有侵袭性的胶质瘤，表现为有瘤组织内细胞丰富，瘤细胞大，明显核异型，核分裂多见，血管内皮细胞增生，可见大量的不成熟血管，可合并大片出血和坏死。原发的GBM多发生于55岁以上的中老年患者，而继发的GBM多发生于年龄小于55岁患者中，是由低级别胶质瘤发展而来，占CBM的5.0% -10%。WHOⅡ级和WHOⅢ级胶质瘤发展成GBM的时间平均为5年和2年。在分子病理水平上，原发GBM(5.0%)的IDH突变明显低于继发GBM(84.6%)。五、当前的治疗方法目前治疗指南建议对胶质瘤采用手术和（或）放疗和（或）化疗的综合治疗方式。手术推荐最大程度安全切除肿瘤；放疗推荐分次外照射；化疗推荐替莫唑胺（TMZ）化疗。替莫唑胺是相对耐受良好的口服烷化药剂，易通过血脑屏障，在细胞内转化为强效的烷化剂，使鸟嘌呤烷基化，损伤DNA，导致瘤细胞死亡。现有的标准治疗还未达到个体化治疗的水平。六、胶质瘤分子标志物（表1）（一）IDH突变1．背景：异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是三羧酸循环中的一种关键性限速酶，催化异柠檬酸( isocitrate)氧化脱羧生成a-酮戊二酸(a-KC)及C02，为细胞新陈代谢提供能量和生物合成的前体物质。IDH基因家族有三种异构酶（IDHI，IDH2和IDH3）。IDHI催化反应生成的产物包括a-KG和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，NADPH作为体内还原性氢的供体一方面参与了细胞抵御氧化应激反应；另一方面还参与了不饱和脂肪酸的氧化过程。a一酮戊二酸可能与胶质瘤的发生有关。IDHI和IDH2的突变在原发性GBM中发生率很低(5. 0%)，但是在继发性CBM( 84. 6%)和WHOⅡ级、Ⅲ级胶质瘤(星形细胞瘤(83.3%)、少突胶质细胞瘤(80.4%)、少突星形细胞瘤(100%)、间变性星形细胞瘤(69.2%)、间变性少突胶质细胞瘤(86. 1%))中发生率很高。IDHI/IDH2突变发生在胶质瘤形成的早期，随后根据星形细胞或少突胶质细胞的谱系分化不同可以分别伴随TP53基因突变或lp/19q杂合性缺失。在继发性GBM和低级别弥漫性胶质瘤中，IDHI/IDH2基因突变与TP53突变、染色体lp19q杂合性缺失以及06_甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶( MGMT)启动子区甲基化状态呈正相关；在原发性CBM中，IDHI基因的突变与10号染色体缺失和ECFR扩增呈负相关。IDHI/IDH2突变独立于常规预后指标包括染色体lp/19q状态及MCMT基因启动子甲基化，与较长的无进展生存期有关。IDHl/IDH2基因的突变通常发生在年轻成年人和青少年弥漫性胶质瘤患者中。超过90%的IDH基因突变为IDHI突变（以R132类型最为常见），其余的为IDH2突变，IDH2突变发生在同源的密码子（密码子172），至今未有IDH3突变的报道。含有IDH基因突变的高级别胶质瘤有显著较好的预后。IDH突变状态对胶质瘤预后的影响被认为优于组织学分级。IDHl/IDH2突变对间变性星形细胞瘤和GBM的预后有很强的预测价值：IDHl/IDH2突变的间变性星形细胞瘤和GBM的生存期分别为65与20个月，而IDHl/IDH2野生型的间变性星形细胞瘤和GBM的生存期仅为31与15个月。虽然IDH突变对高级别胶质瘤的预后有很强的预测价值，但是对于低级别弥漫性胶质瘤预后作用还不明确。IDHl( R132H)突变占IDH总突变的90%以上，它是由IDH1基因第395位的鸟嘌呤突变为腺嘌呤(CGT—CAT)，进而导致编码蛋白中第132位精氨酸(R)被组氨酸(H)取代所造成。IDHl的这种突变多发生于青年患者和继发性GBM患者，并且发生突变与患者的总生存率成正相关，野生型IDHI患者平均存活时间仅I.I年，而突变型IDHI患者平均存活时间则长达3.8年。IDHI突变在胶质瘤中具有普遍性，针对IDH突变蛋白的抗体已经成为检测IDH突变情况的常规手段。考虑到突变体特异性抗体的可靠性，可以用免疫组织化学方法评估IDH( R132H)蛋白表达，若结果显示阳性，可以看作存在突变；若结果显示阴性，可以进一步检测132和172氨基酸的IDHI和IDH2序列来排除突变。此外，IDH突变在GBM年轻患者发生率较高，建议50岁以下的GBM患者首选检测。2．实验室检测方法：在基因水平，可采用焦磷酸测序；在蛋白质水平，可采用免疫组织化学法。推荐使用焦磷酸测序。3．建议：在各级别胶质瘤中，相对于IDH野生型，IDH突变型的患者预后较好。IDH突变状态可辅助诊断胶质瘤。（二）MGMT启动子甲基化1．背景：06-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)定位于lOq26,编码一种修复06_甲基鸟嘌呤的酶。其启动子包括富含97个CG二核苷酸（cpG位点）的CpG岛。在正常组织中，cpG位点一般都处在非甲基化状态。CpG位点甲基化会导致染色质结构改变，从而阻止转录因子结合、导致基因的沉默。MGMT主要分布于细胞质，DNA损伤后才转移到细胞核。在细胞核中，MGMT可以使烷化剂作用下形成的06位甲基化鸟嘌呤去甲基化，有效地修复DNA损伤，同时自身不可逆失活为烷基化MGMT。MGMT -个分子只能修复一个烷基加合物，因此，MGMT被称为“自杀”酶。细胞的修复能力取决于MGMT在细胞内的含量和合成速率，而MGMT基因启动子甲基化可以导致基因沉默和抑制蛋白合成，阻碍DNA的修复。MGMT启动子甲基化在少突胶质细胞瘤中发生率为60%- 80%，在混合性少突星形细胞瘤发生率为60% -70%，在GBM发生率为20% -45%，在间变性星形细胞瘤中发生率为40%- 50%，在毛细胞型星形细胞瘤发生率为20% - 30%。在继发性GBM和低级别弥漫性胶质瘤中，MGMT启动子甲基化状态与IDH基因突变 和lp/19q缺失的状态呈正相关。复发胶质瘤样本中MGMT启动子甲基化水平较第一次手术样本多有明显的增加，但胶质瘤患者的中位生存期只受初治胶质瘤中MGMT启动子甲基化状态的影响。在TCGA（癌症图谱研究网络）进行的一项大样本、多中心的原发性GBM研究中，存在MGMT甲基化的CBM患者放化疗后基因组发生了大量的突变，其中包括错配修复(MMR)基因突变，而MCMT蛋白无法修复突变。高级别胶质瘤放疗联合TMZ同步化疗后，影像学上常常出现和肿瘤进展酷似的假性进展，MCMT甲基化者假性进展的发生率明显高于非甲基化者，同时假性进展的出现提示预后较好。具有MGMT启动子甲基化的胶质瘤患者对化疗、放疗敏感，生存期较长。对于70岁以上GBM患者，若KPS评分低于70分，在可耐受的情况下应用替莫唑胺治疗可延缓复发并延长总生存期，改善生存质量；若同时伴有MGMT启动子甲基化，则替莫唑胺效果更佳。老年GBM患者中MGMT基因启动子甲基化发生率高，单纯放疗联合辅助化疗可以延长生存期，而无MGMT基因启动子甲基化的老年患者辅助化疗并没有延长生存期。2．实验室检测方法：焦磷酸测序或甲基化特异性PCR是评估MGMT启动子甲基化状态的最佳选择。用免疫组织化学检测MGMT蛋白表达从而推测MGMT启动子区甲基化状态并不可靠。推荐焦磷酸测序的方法。3．建议：MGMT启动子甲基化提示GBM患者预后较好。对于年龄>70岁的老年患者，如果有MGMT启动子甲基化，放疗联合辅助化疗或单纯化疗可以延长生存期，改善生活质量；无MGMT启动子甲基化的老年患者不建议辅助化疗。（三）染色体lp/19q缺失1．背景：染色体lp/19q联合性缺失(codeletion)是指1号染色体短臂和19号染色体长臂同时缺失，最早发现于少突胶质细胞瘤样本中。lp/19q联合性缺失在少突胶质细胞瘤中的发生率为80% -90%，在间变性少突胶质细胞瘤中发生率为50%- 70% ，在弥漫性星形细胞瘤中发生率为15%，而在胶质母细胞瘤中发生率仅为5.0%。具有lp/19q联合性缺失的少突胶质细胞瘤患者通常伴随着IDH基因的突变，MGMT启动子甲基化，和G-CpG岛甲基化表型( G-CIMP) ，但是与TP53突变相互独立发生。目前认为lp/19q联合性缺失是少突胶质细胞瘤的分子特征，是其诊断性分子标志物。通常对疑似少突胶质细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤均应进行lp/19q联合性缺失的检测，从而协助组织学的诊断，lp/19q缺失可以帮助区分混合性少突星形细胞瘤更倾向于少突还是星形，这对于治疗选择有一定的意义。存在lp/19q联合性缺失的少突胶质细胞瘤生长速度较慢，并对化疗敏感。目前的治疗指南对少突胶质细胞瘤均推荐检测lp/19q联合性缺失的状态，用替莫唑胺或单纯放疗治疗lp/19q联合性缺失的少突胶质细胞瘤的患者均会延长无进展生存期，仅有lp缺失的患者进行单一治疗的时候也会延长无进展生存期。一项1000例病例的大规模的国际临床回顾性研究表明，对lp/19q联合性缺失的间变性少突胶质细胞瘤患者进行替莫唑胺(TMZ)单纯化疗和PCV联合放化疗，PCV化疗方案（甲基苄肼+洛莫司汀+长春新碱）比TMZ化疗方案对肿瘤控制更好，但是否能够延长存活期并不明确。对于伴有lp/19q联合性缺失、无症状的少突胶质细胞瘤患者，肿瘤生长缓慢并且总生存期长，一部分医师选择了临床观察。而对于有症状的患者，治疗效果较好，治疗后能改善症状、提高生活质量。2．实验室检测方法：实验室检测lp/19q状态的方法包括荧光原位杂交、基于杂合性缺失分析的聚合酶链式反应(PCR)和阵列比较基因组杂交(CGH)。推荐采用荧光原位杂交技术。3．建议：对于有lp/19q联合缺失的少突或间变性少突胶质细胞瘤患者，推荐化疗或联合放化疗。（四）EGFR扩增和EGFRvⅢ重排1．背景：表皮生长因子受体( epidermal growth factorreceptor，EGFR)基因定位于染色体7p12，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体( EGFR/Erb/Herl)。EGFR编码蛋白有三个功能结构域：分别是细胞外段的氨基酸结合区、跨膜区和细胞内段的酪氨酸激酶区。EGFR与EGF、TGF-a或双调蛋白( amphiregulin，AR)的结合后使酪氨酸激酶磷酸化，进一步激活胞内下游信号通路(促分裂原活化蛋白激酶( MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶( PI3K)，从而促进细胞增殖、迁移。EGFR扩增在许多癌症中的发生并不普遍，而在脑胶质瘤中确有很高的发生率，并常常伴随编码蛋白的过表达。间变性星形细胞瘤中EGFR扩增的发生率为17%，GBM中的发生率为50%- 60%，TCGA的经典型与Phillips增殖型和间质型的发生率高达94%。组织学上，小细胞GBM中GFAP表达很低，从形态学上难以和高级别的少突胶质细胞瘤相鉴别。由于小细胞GBM中EGFR扩增很普遍，据此能鉴别诊断小细胞GBM与高级别的少突胶质细胞瘤。对于临床症状和神经影像学提示诊断为GBM的患者，由于取材的局限导致组织病例学上不能充分的证明是GBM，针对EGFR扩增进行检测就能确诊或排除GBM的诊断。FISH可以确定的检测EGFR扩增，所以可作为判定肿瘤级别的一个备选指标。在临床上，60岁的CBM患者伴随EGFR扩增提示预后不良。存在ECFR扩增的肿瘤可以伴发其他EGFR基因的改变，最常见的是外显子2-7框内缺失形成的EGFRvⅢ重排，EGFRvⅢ重排在GBM患者的发生率为20% - 30%。EGFR的扩增会导致EGFRvⅢ成为截断体蛋白，从而不能绑定配体的短胞外区。由于降解能力受损和激酶活性增加，EGFRvⅢ重排能够激活下游信号转导通路。EGFRvⅢ重排是否与预后相关还存在着争议，但是长期来看，有EGFRvⅢ重排的患者预后有差的趋势。至今EGFR的靶向治疗对治疗GBM还没有明显的疗效，然而EGFRvⅢ重排给我们提供了一个靶向治疗的平台，多个二期临床试验已经发现针对于EGFRvⅢ重排的疫苗能够改善患者的预后。现在，三期临床试验(ClinicaITrials. gov，No.NCT01480479)正在进行。对于EGFRvⅢ重排阳性的GBM患者，可通过监测外周血EGFRvⅢ重排来观察治疗反应并能监测是否复发。未来针对于EGFRvⅢ重排的疫苗有望改善EGFRvⅢ重排阳性患者的预后。2．实验室检测方法：EGFR扩增：荧光原位杂交；EGFRvⅢ重排：实时定量PCR，免疫组织化学，多重探针依赖式扩增技术。推荐使用荧光原位杂交检测EGFR重排。3．建议：有EGFR扩增的大于60岁的GBM患者预后差，诊断方面的意义表现在两方面：对小细胞GBM的诊断；辅助判定活检组织的病理结果。（五）PTEN基因突变1．背景：磷酸酯酶与张力蛋白同源物( phosphatase andtensin homolog，PTEN)，定位于染色体lOq23.3，是蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTP）基因家族成员，其蛋白产物为含有一酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸左右的与骨架蛋白tenasin、auxilin同源的区域。PTEN是重要的抑癌基因，于1997年首次被报道，是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，也是继TP53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的基因。PTEN蛋白是磷酸酶，它使蛋白质去磷酸化而发挥作用。PTEN参与信号通路的转导，在细胞生长、分裂的速度过快或者分裂不受控制时，能够调控细胞分裂周期，使细胞停止分裂并诱导凋亡，这些功能可以阻止细胞的异常增殖进而限制肿瘤的形成。PTEN还可以辅助抑制细胞转移、细胞与周围基质的粘附和血管发生等功能。此外，它在维持细胞遗传信息的稳定性上也可能具有重要作用。PTEN基因是众多肿瘤预后的评价指标，研究其作用机制对肿瘤的诊断及其基因治疗具有重要意义。PTEN参与了RTK/PI3K通路，86%的GBM患者会有包括PTEN基因缺失和突变的RTK/PI3K通路基因的改变。在原发性GBM中PTEN的点突变率为26% - 34%。间变性星形细胞瘤(18%)突变率明显少于GBM。有PTEN突变的间变性星形细胞瘤患者预后较差。2．实验室检测方法：对外显子区域进行PCR，Sanger测序检测PTEN突变。3．建议：建议对WHOⅢ级和Ⅳ级的胶质瘤样本检测PTEN的突变。有PTEN突变的间变性星形细胞瘤患者预后较差。（六）TP53基因突变 1．背景：TP53为抑癌基因，定位于染色体17p13.1，编码蛋白称为p53蛋白或p53肿瘤蛋白。p53蛋白能调节细胞周期和避免细胞癌变发生。超过50%的人类肿瘤涉及TP53基因突变的发生。TP53基因突变在低级别星形细胞瘤中发生率为50% - 60%，在少突胶质细胞瘤中TP53基因突变发生率很低，混合性少突星形细胞瘤发生率为40%，继发性GBM发生率为70%，原发性GBM发生率为25% -37%。在低级别星形细胞瘤和继发性GBM中，TP53基因突变多在胶质瘤形成早期发生，而在原发性GBM中，TP53基因突变多在胶质瘤形成后期发生，主要是由于基因组的不稳定性增加导致。在弥漫性胶质瘤患者中TP53突变是生存率降低的原因。对于低级别胶质瘤而言，TP53突变提示预后较差，但是对GBM而言并没有预测价值。目前p53蛋白的表达已被作为诊断的生物标志物，可通过福尔马林固定、石蜡包埋的组织定期免疫组织化学检测。然而，其免疫组织化学的结果必须结合详尽的临床信息进行分析，因为无证据证明基因突变和蛋白的过度表达具有相关性，蛋白的过度表达并不能用来推断TP53突变状态。p53在未来有可能成为药物靶点，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性，这还有待进一步的研究。2．实验室检测方法：对外显子区域进行PCR，Sanger测序检测TP53突变。3．建议：TP53突变在低级别星形细胞瘤和继发GBM中发生率高。有TP53突变的低级别胶质瘤预后较差。（七）BRAF融合和点突变1．背景：BRAF基因位于7q34，长约190 kb。BRAF基因编码一种丝／苏氨酸特异性激酶( serine/theronine specific kinase)。BRAF基因是RAF家族的成员之一，RAF家族还包括ARAF和RAFl( CRAF)基因，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。BRAF蛋白由783个氨基酸组成，功能上从N端到C端依次为RAS结合区、富半胱氨酸区( Cys)、甘氨酸环(Cloop)和激活区。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。它主要有CRI、CR2和CR3三个保守区。其中CR1区含RBD区（Ras-binding domain，RAS蛋白结合区）和富半胱氨酸区( Cys)；CR3区为激酶结构域，含甘氨酸环(Gloop)，为ATP结合位点和激活区，该区T598和S601两个位点的磷酸化对BRAF蛋白的激活至关重要。BRAF蛋白的主要磷酸化位点为S364、S428、T439、T598和S601。BRAF蛋白的完全活化需要T598和S601两个位点的磷酸化，这两个位点氨基酸的置换将导致激酶持续性激活。此外，该两个位点的磷酸化对于ERK的BRAF诱导性激活以及NIH3rl3的转化亦很重要。BRAF基因的串联重复导致了基因的融合，如KIAA1549-BRAF和FAM13IB-BRAF（少见）。KIAA1549-BRAF融合在毛细胞型星形细胞瘤中高发（50% - 70%），而在其他级别胶质瘤或其他肿瘤中极为少见。KIAA1549-BRAF融合是一个重要的诊断标志物，由于毛细胞型细胞瘤也存在微血管的增生，在组织学上难以与CBM区分，如果检测有KIAA1549-BRAF融合则高度提示为毛细胞型星形细胞瘤。在各个级别的胶质瘤中，均检测到了BRAF发生在Va1600Glu位点的错义突变。通过针对该种突变的特异性抗体的免疫组织化学检测发现，多形性黄色瘤型星形细胞瘤中约有60% - 70%发生该突变，是突变最多的一种星形细胞瘤。 在毛细胞型星形细胞瘤中发生率为10%，其他胶质瘤中少见。针对于Va1600Clu突变的药物，如威罗菲尼(vemurafenib)，为存在BRAF突变的胶质瘤的治疗提供了新的治疗方式。2．实验室检测方法：KIAA1549-BRAF基因融合：荧光原位杂交，实时定量PCR；BRAFVa1600Glu突变：免疫组织化学，焦磷酸测序。3．建议：KIAA1549-BRAF融合基因和BRAF Va1600Glu突变与毛细胞型星形细胞瘤密切相关，具有很强的诊断价值；是靶向治疗的标志物。 （八）Ki-671．背景：Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少的。Ki-67作为标记细胞增殖状态的抗原，其染色阳性说明癌细胞增殖活跃。Ki-67蛋白存在于所有的有活性的细胞周期中(G1，S，G2，M)，而不存在于静止期(GO)。Ki-67已经作为判定增殖细胞数比例的指标。然而至今为止，并没有确定的阈值作为评定肿瘤级别的指标。Ki-67表达水平均能较客观地反应脑肿瘤的增殖速度和恶性程度，但WHO指南至今仍旧根据有丝分裂的活性来区别II级和Ⅲ级的肿瘤。现在多使用免疫组织化学技术检测Ki-67蛋白，这在病理诊断中已获得普遍认可，在许多肿瘤中，Ki-67阳性标记指数对于区别良恶性、确定分级都有参考价值。总体说来，Ki-67阳性标记指数越高，则恶性程度（分级）越高，预后越差。在不同肿瘤中，其良恶性之间、不同级别之间，阳性标记指数总有一些重叠交叉，而且不同研究者所得的结果还常有相当大的差别，很难一概而论。一般主张选择肿瘤细胞丰富、阳性细胞（定位于细胞核）较多的热点区域，选择至少10个高倍视野，计算这些视野内肿瘤细胞中阳性细胞的平均值(%)，作为Ki-67阳性标记指数。在胶质瘤中，高级别胶质瘤的Ki-67代表的阳性标记指数明显高于低级别胶质瘤。早期及近期研究揭示Ki-67和磷酸化组蛋白H3在弥漫性脑胶质瘤中有预后价值，尤其是低级别弥漫性胶质瘤。在间变性少突胶质细胞瘤中，Ki-67是一个重要的单因素分析预后指标，而不是多因素分析预后指标。2．实验室检测方法：免疫组织化学。3．建议：对于低级别弥漫性胶质瘤是一个预测预后的可靠指标（九）miR-18ld1．背景：微小RNA( miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，约20 - 25个核苷酸。成熟的miRNAs可以降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。miRNA参与了各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。miRNA可以担任抑癌基因或癌基因．与肿瘤的恶性进展有着密切的联系。中国胶质瘤基因组图谱计划( ChineseGlioma Genome Atlas，CGGA)与美国波士顿贝斯医疗中心合作研究发现：与正常脑组织相比，胶质瘤中的miR-18ld表达明显下调，尤其是在GBM中，这个结果在TCGA和独立样本中也得到了证实，miR-18ld连同其他4个miRNA -同可以预测GBM患者的预后。miR-18ld能够抑制胶质瘤的增殖、促进细胞周期停滞并促进凋亡。已证明miR-18ld有多个靶基因，与肿瘤相关的靶点包括KRAS、BCL-2和MGMT。miR-18ld能够负调控MGMT mRNA的翻译，从而使其表达下调，同时在肿瘤样本中miR-18ld与MGMT的表达呈负相关。miR-18ld高表达的患者组的中位生存期明显比低表达的组群长；表达上调的miR-18ld能够增加GBM对替莫唑胺的敏感性，部分的原因是miR-18ld下调MGMT的作用。MGMT有修复DNA损伤的功能，而替莫唑胺能够促进GBM的DNA损伤，miR-18ld通过下调MGMT达到了提高GBM对替莫唑胺敏感性的作用。miR-18ld对于替莫唑胺治疗效果是一个预测因子。同时，miR-18ld的其他靶基因的作用也参与其抗肿瘤作用机制中。在GBM中miR-18ld高表达提示预后较好。2．实验室检测方法：原位杂交。 3．建议：miR-18ld对于GBM是一个预测预后的可靠指标。临床检测miR-18ld的表达水平能提示GBM患者对TMZ化疗的敏感性。七、根据特定基因分类的胶质瘤亚型 胶质瘤分子基因表达研究的进一步开展，将为胶质瘤分类与新型分子治疗靶点的寻找提供更多的依据。Phillips等在一项107例胶质瘤（WHOⅢ和Ⅳ级）的研究中，用35个基因将胶质瘤分为三个亚型：前神经元型，增殖型和间质型。前神经元型表达神经发生相关的基因），具有完整的PTEN、正常的EGFR和Notch信号通路，常发生在40岁左右的人群中，有较好的预后。 增殖型与间质型肿瘤分别表达细胞增殖和血管生成／间质相关的基因，如10号染色体缺失，7号染色体的扩增，PTEN基因的缺失，正常或扩增的EGFR基因和Akt的活化。常发生在年龄稍大的人群中(>50岁)，有不良的预后。Verhaak等在分析了癌症基因图谱计划( The Cancer Genome Atlas，TCGA)中202例GBM的表达谱后，利用了840个基因，将GBM分为四个亚型：前神经元型、神经元型、经典型和间质型。前神经元型的发生率较低，有少突胶质细胞的特性，主要发生在继发性GBM年轻患者中，其主要特点是IDH突变、TP53基因突变和lp/19q杂合性缺失、PDGFR-A改变、10号染色体缺失和7号染色体扩增。神经亚型表现为表达神经元相关基因，包含有星形细胞和少突细胞，其主要特点是ECFR扩增(5/19，26%)，它的表达模式和正常脑组织样本是最相似的。经典亚型表达了神经前体和干细胞的标志物，具有星形细胞的特性，其特点是7号染色体扩增和10号染色体的缺失( 93%)，EGFR扩增(95%)，TP53缺失，激活的Notch和shh( Sonic hedgehogsignaling)信号通路，PTEN缺失(5/22，230-/0)和EGFRvⅢ重排( 5/22，23%)。间质亚型具有培养的星形细胞瘤的特点，包括PTEN缺失(12/38，32%)，NFI基因突变(14/38，37%)，坏死和炎性反应的增加。中国脑胶质瘤基因组图谱计划( chinese glioma genome atlas，CCGA)共利用了225例脑胶质瘤的样本进行了分子亚分型，将脑胶质瘤分为了三个亚型（G1，G2和G3）。G1亚型包含了极度高发的IDH突变，主要见于年轻的患者，有良好的预后。而相对于G1亚型，G3亚型预后较差，主要见于年老的患者，包含了非常低的IDH突变率。G2亚型的以上临床特点介于CI和G3亚型之间，但是lp/19q的缺失在C2亚型中比G1和C3的发生率要高。上述分型使用TCGA和Rembrandt的数据库验证的到了相似的结果。八、胶质瘤分子诊断的质控 分子遗传学和分子生物学的技术进展，将胶质瘤的诊治水准提升到了分子水平，同时也对肿瘤样本的质量提出了更高的要求。因此，肿瘤样本的质量控制是包括胶质瘤在内的所有肿瘤临床样本分子诊断过程中的基本环节。根据胶质瘤术程长、易复发、异质性高等特点，在进行分子诊断检测之前，应当从以下几个方面进行质控。 1．标准操作程序( standard operation procedure，SOP)和临床实践指南( clinical practice guideline，CPG)。一旦胶质瘤样本离开患者身体后，由于缺乏必需的生存环境，必然发生组织降解，使其内部的生物分子发生降解，导致生物信息改变、甚至丢失，从而降低样本的可利用价值。样本降解的速度与很多因素( pre-analytical variables)有关，需要检测的目的生物分子对致降解因素的易感性也各不相同。因而，严格执行SOP与CPG，在分子诊断中将人为影响和环境因素的作用降到最低，才能最大限度地维持所检分子的完整性，确保胶质瘤分子诊断的准确性。2．个体化分析：需要指出的是患者自身体质、肿瘤血运分布、肿瘤细胞组成等个体因素可以对单个胶质瘤标本的降解速度的影响不尽相同；因此，在临床操作中，应当对每例患者样本的取材方法、冷冻时间、保存运输条件等诸多分子诊断前数据做个体化分析。推荐对各例样本进行降解程度评估，用以校正分子诊断结果。对经历放、化疗的患者，做分子诊断时应当考虑放、化疗等因素对所检分子的影响，并区别放化疗因素造成胶质瘤的继发性分子变化。3．推荐的精细化的分子诊断：首先，考虑到胶质瘤的异质性，不宜将整块肿瘤组织一同匀浆进行分子分析；而应当对每例待检样本进行病理切片和组织学观察。根据组织形态学特点，必要时应当在显微镜下（石蜡切片）或冰冻切片机上（冰冻切片）对细胞进行选择性收集( selective tissuedissection)。4．本版本提出的胶质瘤分子诊断指南是在基因水平（包括DNA、mRNA和miRNA）所做的定性分析，无法获知具有基因分子特征的细胞在所检胶质瘤组织中的比例和分布情况，因而在根据这些基因特征选择治疗方案和预后分析时可能出现偏差。为了提高胶质瘤分子诊断水准、最终实现精确精准治疗的目的，适时研发并优化以RNA、蛋白质为标准的定量分子诊断手段，条件允许的时候利用诸如靶向蛋白定量质谱之类的先进技术手段对胶质瘤进行量化的分子诊断，是胶质瘤分子诊断的最终目标与方向。《中国脑胶质瘤分子诊疗指南》编写组成员名单：马文斌（中国医学科学院北京协和医院神经外科）、于士柱（天津医科大学总医院、天津市神经病学研究所神经肿瘤研究室）、王任直（中国协和医科大学北京协和医院神经外科）、王伟民（广州军区广州总医院神经外科）、王洪军（哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科）、王永志（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科、北京市神经外科研究所）、王政（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科、北京市神经外科研究所）、王引言（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科、北京市神经外科研究所）、毛颖（复旦大学附属华山医院神经外科）、毛庆（四川大学华西医院神经外科）、尤永平（南京医科大学第一附属医院神经外科）、史之峰（复旦大学附属华山医院神经外科）、白红民（广州军区广州总医院神经外科）、李文斌（北京市世纪坛医院神经肿瘤内科）、李学军（中南大学湘雅医院神经外科35病区）、李桂林（北京市神经外科研究所神经病理科）、吴安华（中国医科大学附属第一医院神经外科）、陈凌（解放军总医院神经外科、全军神经外科研究所）、陈忠平（中山大学附属肿瘤医院神经外科）、邱晓光（首都医科大学附属北京天坛医院放疗科）、杨学军（天津医科大学总医院神经外科）、周良辅（复旦大学附属华山医院神经外科）、周定标（解放军总医院神经外科）、林毅（中国医科大学附属第一医院神经外科）、赵继宗（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科）、康春生（天津医科大学总医院神经外科、天津市神经病学研究所神经肿瘤实验室）、姚坤（首都医科大学北京三博脑科医院病理科）、蒋传路（哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科）、秦智勇（复旦大学附属华山医院神经外科）、赛克（中山大学附属肿瘤医院神经外科）、樊小龙（北京师范大学生命科学院神经科学和脑发育实验室）、颜伟（南京医科大学第一附属医院神经外科）。分子诊疗指南的参与人员和机构1．胶质瘤分子诊疗指南制定的团队，组长：江涛、毛颖；副组长：马文斌、杨学军、陈忠平。制定小组：王伟民、蒋传路、吴安华、康春生、尤永平、李学军、陈凌、邱晓光、李文斌、秦志勇。学术指导：赵继宗、周良辅、周定标、王任直。2．文献、资料收集和入组评估小组：王洪军、颜伟、林毅、王永志、王政、王引言、姚坤、史之峰。 3．指南起草小组：江涛、毛颖、马文斌、杨学军、陈忠平、毛庆、蒋传路、吴安华、康春生、尤永平、李学军、陈凌、邱晓光。 4．指南修改小组：江涛、毛颖、马文斌、杨学军、陈忠平、毛庆、蒋传路、吴安华、康春生、尤永平、李学军、陈凌、邱晓光、王伟民、李文斌、赛克、白红民。 5．评定、监督小组：李桂林、于士柱、樊小龙、Clark Chen（美国加利福尼亚大学神经肿瘤转化和应用中心）、MinLi（美国德州大学医学院神经外科）。组织机构的共同认证：北京市神经外科研究所、首都医科大学附属北京天坛医院、复旦大学附属上海华山医院、哈尔滨医科大学附属第二医院、天津医科大学总医院、南京医科大学第一附属医院、中南大学湘雅医院、四川大学华西医院、中山大学附属肿瘤医院、广州军区广州总医院、中国协和医科大学北京协和医院、中国医科大学附属第一医院、中国脑胶质瘤协作组( CGCG)、中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)。

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