专家指路：如何追上CRISPR技术快速发展的脚步？
2017-03-09 薄荷 生物通
每个月都有一大波新的CRISPR工具来袭。对于这些热门的技术，我们要不要追？怎么追？对此，《The Scientist》杂志请来一些开发人员，对实验室如何采用这些最新技术提出了一些建议。看点1Cas9的“死亡开关”研究人员：加州大学旧金山分校的研究员Joseph Bondy-Denomy背景：尽管Cas9核酸内切酶颇受欢迎，但由于它们有时在细胞内逗留得太久，而引发脱靶效应，故研究人员正在研究C
每个月都有一大波新的CRISPR工具来袭。对于这些热门的技术，我们要不要追？怎么追？对此，《The Scientist》杂志请来一些开发人员，对实验室如何采用这些最新技术提出了一些建议。
看点1
Cas9的“死亡开关”
研究人员：加州大学旧金山分校的研究员Joseph Bondy-Denomy
背景：尽管Cas9核酸内切酶颇受欢迎，但由于它们有时在细胞内逗留得太久，而引发脱靶效应，故研究人员正在研究Cas9的“死亡开关”。“人们的目标是有一种方法来关闭它，而不是依赖被动降解，”Bondy-Denomy说。在理想的情况下，Cas9将找到完美的靶点，而之后抑制剂防止它进行其他切割。
方法：Bondy-Denomy的团队找到了四种新的Cas9抑制剂，发现其中两种（AcrIIA2和AcrIIA4）能阻断广泛使用的化脓性链球菌Cas9的作用（Cell, 168:150-58, 2017）。研究人员发现，细菌与入侵的病毒大战时，即使它们有CRISPR-Cas9系统也不一定能取得胜利。这时，抑制剂可能起了作用，于是研究人员着手寻找更多。
如何开始：Bondy-Denomy的团队计划在不久的将来把这四种抑制剂放在Addgene上。AcrIIA2和AcrIIA4在HEK293细胞系中起作用。不过，“任何人都可以用它们来研究他喜欢的Cas9版本，”他说。“1号和3号对我们的研究不起作用，但说不定对别人有用。”
至于何时使用抑制剂，他认为每个实验的时机都是不同的。因此，用户需要自己检查off-target编辑是否减少或消失。当然，也要检查on-target的情况。“我们预计一些on-target活性消失，但我们还不清楚，”他说。
未来：研究小组正利用向导RNA来检验抑制剂。有时，他们希望在特定位点固定一个点突变，这个目标后面需要跟随着一个PAM序列。在编辑之后，PAM序列也需要改变，否则目标位点会被再次切割。这时，抑制剂实现了Cas9的瞬时激活。
看点2
CRISPR + 单细胞测序
研究人员：加州大学旧金山分校的教授Jonathan Weissman以及Broad研究所的核心成员Aviv Regev
背景：与不断扩展的CRISPR-Cas9工具箱一样，单细胞测序技术近年来也发展迅速。研究人员提出了基于液滴的方法，而首批商业化平台也即将上市。
方法：《Cell》杂志上发表的三项研究表明，人们可采用CRISPR-Cas9工具进行基因编辑和基因抑制，然后开展高通量的单细胞RNA-Seq（Cell, 167:1853-66, 2016; Cell, 167:1867-82, 2016; Cell, 167:1883-96, 2016）。
Weissman和Regev的新技术被称为Perturb-seq，此系统的关键在于能够在单细胞的转录组中确定CRISPR带来的扰动。大多数单细胞RNA-Seq方法需要捕获RNA 3’端的poly(A)尾，但向导RNA通常不带有poly(A)尾，因此不能直接捕获。于是，研究人员提出了一种条形码策略来识别向导RNA。另一个关键步骤是开发一种分析管道来解析大量的数据。
如何开始：研究人员使用10X Genomics的平台来进行单细胞RNA-Seq，这对许多人来说还有点陌生（延伸阅读：10X Genomics发布升级版测序平台）。不过，Norman表示，Perturb-seq也可以在96孔板中进行，使用Drop-seq方法。此外，你应当使用你喜欢的Cas9变体。
他们添加条形码和表达向导RNA的载体很快就能通过Addgene获得。利用这种方法，研究人员在理论上能够集中不同实验的细胞，以便降低成本。数据分析可以在标准的计算集群上完成；不过请做好心理准备，挖掘数据可能至少需要几个月的时间。
未来：Weissman的团队计划发布一个更详细的实验方案，他和Regev的团队将发布他们开发的一些计算工具。他们希望这项技术变得触手可及。《Nature Methods》新技术：CRISPR+单细胞测序=？
看点3
归巢向导RNA（hgRNA）
研究人员：加州大学圣地亚哥分校的生物工程系助理教授Prashant Mali和哈佛医学院的遗传学教授George Church
背景：谱系追踪对发育生物学至关重要。在过去的一年中，几个研究小组已采用CRISPR-Cas9方法来追踪细胞命运。他们在细胞发育过程中追踪基因组中的Cas9编辑。
方法：最新突破是归巢向导RNA（homing guide RNA，hgRNA），它指导Cas9到达自己的DNA位点，从而切割自身。这可作为一个多样化的条形码，让Mali和Church的团队追踪培养的细胞群体。这种方法是独特的，因为经过编辑的hgRNA保留了靶向自身的能力，故它们的寿命可能比其他用于谱系追踪的条形码更长。此外，条形码被转录，因此研究人员可以利用RNA检测方法来读取它们，比如Church实验室开发的荧光原位RNA测序（FISSEQ）。Mali在最新的文章中详细介绍了这种条形码（Nature Methods, 14: 195-200, 2017）。
如何开始：Mali认为，这种工具实际上很容易实现。它归结为创造细胞，并融入特定的条形码。检测也不一定是FISSEQ，任何单细胞测序方法也许都有效。与标准的向导RNA一样，归巢向导RNA也需要从实验上检验。在切割时形成的一些自发突变有可能引发大的插入或缺失，并破坏归巢活性。“找到适合你应用的组合将是至关重要的，”Mali说。例如，如果你想要追踪多次细胞分裂，那么你需要一个停留更长时间的向导。“至少在这一刻，我们还没有如何选择最佳hgRNA的确切规则，”他说。
未来：从理论上说，这些条形码可产生足够数量的变体，覆盖整个小鼠大脑中的各种细胞类型。研究小组目前的重点是在体内进行研究。
看点4
对RNA下手
研究人员：Broad研究院的核心成员张锋（Feng Zhang）以及国立卫生研究院的高级研究员Eugene Koonin
背景：常规的CRISPR-Cas9对研究那些转录但不翻译的基因（即非编码基因组）不是太理想。若能直接操控RNA，研究人员将更好地了解RNA，并开发出基于RNA的疗法，如抗病毒药物。
方法：在一项概念验证研究中，张锋与Koonin的团队合作研究了新的CRISPR效应物C2c2，它切割单链RNA中的特定目标（Science, 353:aaf5573, 2016），并降解细菌中的特定mRNA。两个研究小组发现了许多不同“风味”的C2c2。通过与其他人合作，他们正在研究这16个直系同源物，并在不同应用中检验它们。
与抑制基因表达的RNA干扰工具不同，C2c2可定位在细胞内。“你可以把它带到细胞核中，让它在那里发挥作用。它将成为探索非编码基因组的有力工具，”张锋课题组的研究生Omar Abudayyeh说。
如何开始：原始的C2c2质粒可以从Addgene处获得，不过需要注意的是，它并不是针对哺乳动物细胞的使用而优化的。它更有可能在细菌中起作用，或者植物，但他们还没有尝试过，Abudayyeh说。
即使是目前的直系同源物，在尝试靶向某个转录本时，还是存在差异。这不仅是因为序列本身，还在于转录本是否可接近。许多转录本有二级结构，或与蛋白结合而掩盖了序列。为了解决这个问题，他们建议用多个均匀间隔的向导来铺满你的目标。此外，预测RNA结构的计算工具可能有助于你了解特定目标的成功可能。当然，重点是检查蛋白质表达情况，以确定C2c2是否起作用。
未来：除了鉴定C2c2的新同源物，Broad的研究人员正在开发guide-tiling芯片，这有点类似于芯片，不过用寡核苷酸探针作为向导，目的是开发出一组规则，能够帮助人们预测向导的成功可能。
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