Mol Cell丨吴强组发现Cas9切割DNA末端的多样性，破除了已有的认识
2018-07-20 BioA BioArt
CRISPR/Cas9系统是近年国际上兴起的新一代基因编辑技术。这一划时代技术虽源于细菌和古生菌，但在真菌及高等动物植物基因组改造中，以及农业科学、生命医学、新药创制等“卡脖子”领域已得到了迅速而广泛的应用。近年来，我国基因编辑研究工作获得空前的发展。在多个物种的基因编辑领域实现了国际“并跑”到“领跑”的转变。国际上的基因编辑研究应用如火如荼，但对Cas9核酸酶的切割原理和切割后的修复机制研究还比
CRISPR/Cas9系统是近年国际上兴起的新一代基因编辑技术。这一划时代技术虽源于细菌和古生菌，但在真菌及高等动物植物基因组改造中，以及农业科学、生命医学、新药创制等“卡脖子”领域已得到了迅速而广泛的应用。近年来，我国基因编辑研究工作获得空前的发展。在多个物种的基因编辑领域实现了国际“并跑”到“领跑”的转变。国际上的基因编辑研究应用如火如荼，但对Cas9核酸酶的切割原理和切割后的修复机制研究还比较少。
染色体重排包括染色体片段的缺失、反转、重复和易位等，通常与恶性肿瘤等遗传疾病密切相关，这种染色体结构变异造成的恶性肿瘤也是目前治疗人类疾病的最大挑战之一，如治疗白血病的“神药”格列卫的原始靶点就是由染色体重排产生的。染色体结构变异通过造成基因的异位表达、基因拷贝数的变化或三维基因组染色质高级结构异常从而造成基因功能的改变。最近新兴的基因编辑技术为三维基因组染色体异常等相关疾病根本病因的研究以及疾病的最终治疗提供了重要的帮助，尤其是利用CRISPR基因编辑技术构建特定的染色体结构变异疾病模型对于认识发病机理至关重要。但染色体DNA在CRISPR系统的介导下形成断裂后，细胞如何响应并调控DNA断裂末端修复，从而造成染色体的结构变异的呢？这方面关于CRISPR双链断裂和DNA损伤修复的机制研究不多。
2018年7月19日，上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学研究中心吴强教授课题组在Molecular Cell上在线发表了题为Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-mediated Nucleotide Insertion 的最新研究成果。在基因编辑机制方面取得了原始创新性进展，破除了已有的基因编辑认识。揭示了CRISPR/Cas9基因编辑系统全新的切割机理及细胞在染色体重排过程中DNA双链断裂的修复机制，实现了精准的DNA大片段编辑及可预测的碱基插入。
上海交大吴强教授课题组长期致力于利用基因打靶和基因编辑开发基因组DNA大片段敲除技术，研究三维基因组染色质高级结构的动态调控和原钙粘蛋白家族在脑发育中的在体功能。早在2015年，课题组博士生李金环和寿佳就合作发表了关于DNA片段编辑的研究工作，阐述了利用CRISPR双切点的DNA片段编辑技术，开发了基因组DNA大片段编辑的遗传方法，包括反转基因调控元件、敲除基因簇、重复DNA片段等。这种方法比传统的通过同源重组获得DNA片段重排的方法更为高效，为研究基因组上大量未知DNA元件的调控机制以及癌细胞染色质高级结构的变异提供了便利手段。同年，该团队利用这一DNA片段遗传编辑方法对基因组DNA元件进行反转，结合计算生物学，发现了CTCF在三维基因组染色质高级结构折叠的重要规律，相关研究结果发表在Cell杂志上。最近该团队利用基因编辑技术研究原钙粘蛋白脑发育功能也获得了重要进展，于2018年6月份发表于eLife上。
在最新的这项研究中，吴强教授课题组通过in vivo的DNA片段编辑技术，并结合高通量测序及体外断裂实验，发现Cas9核酸酶切割DNA双链能够产生突出末端，而不仅仅是之前研究报道的平头末端断裂方式。所以Cas9所介导的DNA片段编辑产生的碱基加入来源于Cas9切割产生突出末端的多样性，突出末端再通过细胞内DNA聚合酶的碱基补平连接机理实现PAM位点上游区段的特定碱基的加入。
该研究在前期工作的基础上由共同第一作者寿佳和李金环完成，在Cas9核酸酶的切割原理及细胞DNA损伤修复机制方面取得了原始创新，打破了该领域的原有认知。自CRISPR/Cas9新一代基因编辑系统建立以来，人们普遍认为Cas9核酸酶切割DNA双链是产生平头末端的。特别是早在2012年，CRISPR/Cas研究的先驱Doudna和Charpentier发表在Science的研究论文，以及Siksnys发表在PNAS的研究论文，发现Cas9切割DNA产生平头末端，前者进一步报道体外断裂实验所观察到的现象是由于Cas9核酸酶的核酸外切活性所导致的，Cas9具有核酸外切酶活性。
在进一步的研究中发现，成对的靶向RNA介导的CRISPR删除、反转及重复等DNA片段编辑的双链断裂末端的核苷酸加入呈现非常有规律的模式。通过一对靶向RNA分子指引Cas9切割的四种不同PAM构型，结合测序技术和基因工程技术，证明Cas9介导的碱基插入在DNA片段编辑中是能够预测的。这一可预测的染色体重排方法，为研究人类染色体异常等相关疾病提供技术支持，进而有望推动相关领域的发展。同时，该研究通过基因工程改造Cas9核酸酶，使其具有不同的突出末端切割模式。这更进一步证明了Cas9切割末端的多样性。
综上，该研究从根本上挑战了人们对Cas9核酸酶切割DNA的既有认识，可能成为CRISPR/Cas9新一代基因编辑系统基础研究具有转折意义的发现和原始创新，为优化和改造基因编辑技术奠定坚实基础。
DNA双链断裂修复对于维持基因组稳定性具有重要作用。细胞内主要的双链断裂修复机制包括同源重组和非同源末端连接（NHEJ），其中同源重组通路是精准的，而NHEJ通路是随机的。NHEJ修复通路又包括canonic NHEJ （cNHEJ） 和alternative NHEJ（alt-NHEJ）两种相互竞争的非同源末端连接途径。当细胞通过NHEJ通路修复DSB时，在DNA片段的连接处随机发生indel（插入删除）突变会降低DNA片段精准编辑的效率。为了解决片段编辑的精准性问题，该研究发现，敲除或干扰在alt-NHEJ修复途径中起到关键作用的DNA修复蛋白CtIP和FANCD2，能够显着提高CRISPR/Cas9系统介导的基因组DNA片段精准编辑的效率。所以，通常认为随机的NHEJ修复途径其实与同源重组一样，是一种精准的DNA修复通路，为DNA修复领域一直以来具有争议的问题给出了明晰答案。
总之，该研究开发了通过调控细胞修复系统实现精准的DNA片段编辑方法，发现Cas9切割能够产生突出末端，而且cNHEJ是一种精准的修复通路，阐明了DNA片段编辑的机制，发现了染色质重排接头处的特定碱基加入的规律，实现了可预测的DNA片段编辑。这项研究为进一步理解DNA双链断裂修复机制，以及三维基因组DNA片段的编辑应用奠定了重要基础。在基因组编辑工具CRISPR技术飞速发展的今天，该研究系统的阐述了如何利用细胞内修复蛋白介导精准的DNA片段编辑，有望推动对三维基因组染色体异常等遗传疾病的相关研究。
原始出处：
Jia Shou, Jinhuan Li, Yingbin Liu, et al.Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-Mediated Nucleotide Insertion.Mol Cell.DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.021
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