深度解读丨Science报道北大周德敏课题组在病毒疫苗领域的重大突破——附特别点评

BioArt按：12月2日，Science发表了北京大学药学院周德敏教授课题组关于病毒免疫疫苗的突破性研究成果，论文题为“Generation of Influenza A Viruses as Live but Replication-Incompetent Virus Vaccines”，该论文的唯一单位是北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，药学院院长周德敏教授是该文的通讯作者，张和礼院士（周德敏教授博士期间的导师）是本文的作者之一。该项研究以流感病毒为研究模型，发明了一种全新的人工控制病毒复制从而将病毒由致命性传染源变为预防性疫苗的技术，这一技术突破了现有的疫苗设计手段，开创了新的病毒疫苗设计体系，是病毒疫苗研发领域的一项重大突破，意义巨大。据北大药学院官网介绍，该项研究引发了国内外多家主流媒体的广泛报道。

一直以来，将具有生命威胁的病毒制备成无毒力活性疫苗都被看成是疫苗学的革命，因为在病毒疫苗制备中，都需要尽可能的削弱病毒的毒力，同时尽最大可能保留其感染力以维持免疫活性，但是灭火或者减活病毒疫苗常常表现出生产率低下和效能不足。北京大学周德敏教授实验室的博士研究生司龙龙、徐欢以共同第一作者身份发表的Science文章以流感病毒为例从理论上证实制备免疫力更强，免疫谱更广泛的无复制能力活病毒疫苗是可行的。

该项研究工作中利用了MbpylRS/tRNACUA（MS pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNACUA pair）与UAA（unnatural amino acid：Ne-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine）联合使用的翻译系统。该翻译系统在普通细胞中不存在，作者利用琥珀密码子（终止密码子）可以识别非天然氨基酸的原理进行的人为改造，产生表达该翻译系统的转基因细胞。在表达该翻译系统的293T细胞中，当DNA序列上出现TAG的终止密码子时，在细胞中添加UAA的情况下，蛋白翻译不会终止。作者将病毒复制基因（NP, nucleoprotein; PB1and PB2, polymerase basic proteins 1 and 2; PA, polymerase acidic protein）的某个或部分编码密码子突变成TAG终止密码子，当这些病毒基因转染普通293T细胞（conventional cell）的时候，由于蛋白翻译过程中遇到终止密码子导致病毒蛋白翻译失败，从而无法产生新病毒。当这些基因转染改造的293T细胞（transgenic cell）的时候，由于细胞可以翻译TAG终止密码而正常产生新病毒。该研究工作的构建原理如下图：

由于在病毒基因组中引入的是终止密码子，在transgenic cell中是用非天然氨基酸替代原有的氨基酸，那么引入的氨基酸可能会影响病毒蛋白结构和功能，对病毒产生能力也可能造成影响，尤其是引入的突变位点较多的时候。同时由于病毒本身是具有高度突变能力的，那么引入的终止密码子有可能会被病毒逆转有义密码子而变成有复制能力的病毒。针对这些问题，作者实验证实确实存在这样的可能，并且进行了病毒生成能力和终止密码子逃逸概率的统计。随着突变位点的增多，病毒生产能力确实会受到影响。终止密码子的逃逸概率与突变的具体位点有关，同时多位点终止密码替换导致的逃逸率也下降。单位点终止密码突变的概率在10-8，双位点终止密码突变的概率1.2x10-10，三位点终止密码突变的逃逸概率小于10-11（难以检测）。终止密码子替换数量对产毒能力和逃逸概率的影响如下图：

从安全性的角度考虑，用突变的办法获得的病毒如果作为疫苗使用，安全性和同类临床应用的减活或灭活疫苗相比是类似的。至少从基础研究层面的动物实验（BALB/c小鼠鼻腔给疫苗的方式）结果看起来结果是非常理想的。如下图：

从疫苗有效性角度考虑，通过这种突变的方式获得的病毒活性疫苗的免疫作用对机体的保护作用有多强，作者分别用对照（vehicle），终止密码子突变毒苗（PTC-4A）和临床应用的灭活（IIA）和减活（CAIV）疫苗做了比较。采用疫苗免疫3周后，用同种野生型的流感病毒测试疫苗的保护作用，发现终止密码子突变毒苗的效果与减活毒苗CAIV的效果相当。

由于流感具有高度可变性以及多种属特点，突变毒苗（来源品系influenza A/WSN/33 (H1N1; WSN)）是一种全活病毒，是否对异种流感病毒有免疫保护作用？作者通过异种病毒（influenza A/reassortant/NYMC X-179A (pH1N1) or A/Aichi/2/68 (H3N2)病毒）做了异源免疫保护测试，发现对异种病毒（H1N1和H3N2）也具有较好的免疫作用。如下图。这种免疫作用从文中给出的解释来看，可能还是归功于病毒蛋白的保守区域的原因。这个结果放在补充材料里边，可能是由于Science杂志的篇幅限制。如果该实验中能补足临床在用的减活疫苗（CAIV）的对比作用会更好，从而能体现出这种突变疫苗相比减活疫苗的更强的免疫作用。也许作者做了，可能由于其他原因，未同时展示。

这样的改造病毒疫苗具有提前免疫作用，那么在使用的过程中，如果和野生型病毒同时存在于细胞内的时候，是否会放大疫苗的毒活性呢？因为野生型病毒是未突变的，具有完整的复制能力。实验发现，终止密码子突变病毒与野生型病毒同时感染细胞时，野生型病毒的复制能力反而下降；下降程度与野生型病毒和突变病毒的配比有关，同时与终止密码子引入的数量有关。如下图。通过进一步的测序证明，这是由于野生病毒与突变病毒之间发生了重组（genetic reassortment），导致产生的子代病毒中至少有一个复制缺陷的突变基因片段，使得子代病毒也出现复制缺陷。虽然作者未说明，这种现象可能与突变株产生的不完整蛋白与野生型病毒产生的完整蛋白之间的竞争作用，也会降低病毒的复制能力。这说明多终止密码突变的病毒还具有中和已感染病毒的能力，甚至是治疗作用。

如果通过这种突变的方式能广泛的产生病毒疫苗，将极大的改善疫苗的制备，提高有效性和产率。这种策略甚至可以在一些病毒感染的危重病人中采用相对积极的临床治疗，比如HIV，Ebola等病毒感染者。如果有效，这种影响力将不亚于Car-T免疫靶向治疗肿瘤。另外，由于涉及到转基因，未来可能会考虑生物安全，这种突变会不会和人体的某些基因DNA序列之间发生重组，比如polymerase，如果会，也将可能是一个安全隐患。虽然有媒体报道的可能能作为国防生化安全的防御性策略，但同样亦可以成为生化安全的担忧，不过这与科研本身是不同的层面。未来可能还有些研究工作可以继续开展，比如利用大规模的测序，探测不同种或者同种不同亚系病毒的序列保守性，针对性的设计效果更好的病毒疫苗。以及和人体基因组之间的序列比较，选择更低安全风险的策略。这项工作也让我想到巴西在预防寨卡病毒时尝试采用的策略，用携带致死基因的蚊子消灭蚊子来预防寨卡病毒的传播。

周德敏教授课题组的这项工作意义重大，前文已经描述的非常清楚了，评论中不再赘述。这里笔者想讲讲整个研究的最初的一些不为众人所知的背景。周教授博后生涯（1999-2002）是在Scripps研究所Peter G. Schultz教授实验室度过的，熟悉“遗传密码子拓展”领域的同行应该知道Peter教授是这个领域的权威，而周教授这篇Science的核心部分就是运用了这种改造密码子翻译技术，并将这种技术引入病毒体内改造病毒进而开创了新的病毒疫苗设计体系。Peter教授目前是Scripps研究所所长，他37岁当选美国科学院院士，38岁获得沃夫化学奖并成为HHMI研究员，目前已经发表了近600篇研究论文，是化学生物学、合成生物学和材料生物学领域的顶尖级科学家，他在全球范围内率先建立起了高通量小分子化学药物筛选系统应用于生物学研究，除了周德敏教授之外，华人生物圈内还有多位知名科学家出自Peter教授实验室，例如UCSF/现任清华药学院首任院长的丁盛教授、北大化学分子与工程学院陈鹏教授、UCSF药物化学系PI、Associate Professor王磊等。周教授这篇Science在Acknowledgments中提到了一个基金号“2016YFA0501500”，事实上这个基金号是一个国家重点研发计划“蛋白质机器与生命过程调控”重点专项课题，首席科学家是北大陈鹏教授，实际上早在6年前，周德敏教授就主持了一个973项目——《基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法》，其实这个973项目为如今这篇Science的工作奠定了坚实了基础。总的来说，这项研究并不是一蹴而就的，它的背后有着周教授课题组多年来积累的经验，在这些经验之上然后把技术应用于病毒疫苗设计最终获得成功，应该说这是基础研究走向应用型研究的一个非常典型的例子，所以说在基础研究方面国家投入大量的科研经费是非常有必要和值得的，希望今后国内能涌现出更多这样基础到应用转化的世界一流成果。

周教授团队的研究是一种“全新的、前所未有的方法”，为我们对抗病毒指明了新路。然而，他同时也表示了对这项研究近期用于临床的担忧。这种人工改造的病毒有可能发生意外的突变，打破原本对其自我复制性的限制，这将带来不可估量的后果。此外，人造病毒和天然病毒重组后的结果可能并不像我们预期那样好。孟颂东表示：“这项研究的风险在于改造后的病毒可能变得毒性更强，甚至复制更快。我认为，没有任何国家的卫生部门，尤其是中国，会批准在病人体内接种活性病毒疫苗。”

（注：这段评论来源于微信公众号DeepTech深科技，微信号：mit-tr）