NSR：填补领域技术空白，杨辉团队首创颠覆性鸟嘌呤碱基编辑器

目前的DNA碱基编辑器含有核酸酶和DNA脱氨酶，可以对胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)进行脱氨，但目前还没有对鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)进行编辑的方法。

2023年5月16日，辉大基因/中国科学院上海脑科学与智能技术卓越创新中心/中国科学院神经科学研究所杨辉团队在National Science Review在线发表题为“Programmable deaminase-free base editors for G-to-Y conversion by engineered glycosylase”的研究论文，该研究通过将Cas9切口酶与工程化的N-甲基嘌呤DNA糖基酶蛋白(MPG)融合，开发出了一种具有G编辑能力的无脱氨酶糖基酶鸟嘌呤碱基编辑器(gGBE)。

使用内含子分裂EGFP报告基因，通过对MPG进行多轮诱变，作者表明gGBE与工程MPG可以将G编辑效率提高1500倍以上。此外，gGBE在人类细胞和小鼠胚胎中均表现出高碱基编辑效率(高达81.2%)和高G-to-T或G-to-C(即G-to-Y)转化率(高达0.95)。综上，该研究通过赋予工程DNA糖基酶选择性切除新型底物的能力，开发了一种新的碱基编辑方法。

碱基编辑是一项强大的基础研究和治疗应用技术。目前的碱基编辑器主要包含可编程的DNA结合蛋白。在过去的几年中，两类主要的DNA碱基编辑器，腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)和胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)已经被开发出来，并广泛用于A-to-G和C-to-T转化。最近，C-to-G碱基编辑器(CGBEs)和腺嘌呤转化碱基编辑器(AYBE)也通过将现有的CBE或ABE与DNA糖基酶变体融合来构建，以产生新的工具来实现更通用的碱基编辑结果，包括C-to-G、A-to-C和A-to-T编辑。截止目前为止，这些碱基编辑方法都是从C和A的脱氨开始，分别作为产生尿(U)和肌苷(I)中间体的关键步骤，然后通过内源性DNA修复或复制机制转化为其他碱基。虽然未编辑链中的G和T可以分别随着编辑链中C和A的编辑而被修改，但现有的碱基编辑器无法直接编辑G或T。

碱基切除修复(BER)途径中的碱基切除蛋白已成功用于开发新的碱基编辑工具。BER的机制涉及一个DNA糖基化酶执行的损伤特异性步骤，随后是碱基损伤事件，最常见的是自发DNA去嘌呤化和脱氨化。G不太可能通过脱胺发生突变(由于自发修复)，T不可能通过脱胺发生突变(由于缺乏胺)，这使得G和T碱基编辑器的开发成为一项具有挑战性的任务。受损的G和A在基因组DNA中经常发生去嘌呤化，并通过DNA糖基化酶产生无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，启动BER，容易修复这些碱基的损失。

传统碱基编辑器和基于糖基酶的碱基编辑器的设计和机制（图源自National Science Review ）

MPG(也称为烷基腺嘌呤DNA糖基化酶，AAG)是DNA碱基损伤的第一反应者之一，能够识别多种受损的嘌呤碱基。尽管MPG也可以在体外以非常低的速率去除正常G，但与WT小鼠相比，转基因小鼠中MPG的过表达并未导致额外的点突变，这支持了MPG切除导致的AP位点被APE1 (APE1)快速加工成单链断裂(SSBs)的观点，而单链断裂不能通过翻译合成(TLS)发生突变。这意味着去纯化启动BER可以用于开发新的碱基编辑工具，这些工具可能被证明是可靠和无副作用的。作者推测，可以通过设计MPG蛋白片段来实现典型G的切除，从而通过BER途径进行有效的碱基编辑。

该研究发现DNA糖基酶可以被工程化改造成选择性地去除特定核苷酸碱基的蛋白质。因此，除了该研究所示的G碱基编辑之外，还可以通过类似的蛋白质工程方法开发基于糖基酶的碱基编辑器，对A、C和T进行碱基编辑，为基因编辑研究提供一套完整的碱基编辑工具。

辉大基因创新研究院童华威博士、刘纳纳博士、魏迎辉博士、周英思博士、李芸和吴丹妮为该论文的共同第一作者。辉大基因创始人&首席科学顾问杨辉博士、辉大基因创新研究院童华威博士为该论文的通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nsr/nwad143