罗永章：血浆Hsp90α是一个全新的肿瘤标志物

7月3日的第八届中国肿瘤内科大会暨第三届肿瘤医师大会上，清华大学生命科学学院的罗永章教授做了题为“血浆Hsp90α是一个全新的肿瘤标志物”的主题报告。　　

肿瘤标志物（Tumor markers）是由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的、标志肿瘤存在和生长的一类物质。它在肿瘤患者体内的含量远远超过健康人群，在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。目前，临床常用的肿瘤标志物有十余种，但这些肿瘤标志物的临床性能各有优缺点。截止2011年，美国国家癌症研究院公布了31个被明确用于癌症检测的产品，其中以血液为检测对象的有17个，均由外国科学家发现和定义，尚无我国自主发现的肿瘤标志物在临床中被广泛应用和认可。2012年全球体外诊断市场约为436亿美元，预计2018年将达到588亿美元，复合增速达到5.1%。2012年国内诊断试剂行业市场规模约为160亿元，每年以约15%的速度增长，但罗氏、雅培、西门子、贝克曼等外企公司长期占有我国60%的市场份额。因此寻找灵敏度高、特异性好、具有自主知识产权的新型肿瘤标志物是中国科学家面临的巨大挑战。

肿瘤的发生是一个多步骤的、逐步进展的过程。人们发现，肿瘤的恶性转变和转移扩散才是造成癌症病人死亡的主要原因 (1)。我国80%的癌症患者确诊时即属于中晚期，平均五年存活率仅为25%，其中肺癌仅为10%。世界卫生组织指出，如果能早期诊断并及时治疗，90%～95% 的肿瘤是可以治愈的。因此，早发现是癌症防治的关键。我们的研究发现，在肿瘤早期，分子水平的转移就已经开始了。如黑色素瘤在转移前会破坏远端肺部血管结构，使肺部血管发生“渗漏”，为癌细胞（种子）的转移准备了“土壤”，这为转移早期检测提供了新思路 (2)。然而，肿瘤细胞具体分泌了什么因子导致前转移微环境的变化并不清楚。但是，非常有趣的是，我们发现热休克蛋白90α（Hsp90α）可能在这个过程起到至关重要的作用。

多年来，我们一直致力于研究肿瘤发生及转移过程中的起到关键作用的蛋白质——热休克蛋白90α。我们发现细胞外的Hsp90α是一个受到严密调控的、肿瘤细胞主动分泌的产物 (3)。并且分泌型Hsp90α能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化 (4)，也通过稳定并激活与胞外的金属基质蛋白酶，进而推动肿瘤转移（5）。另一方面，分泌型Hsp90α不仅能够激活肿瘤细胞，对于血管生成也发挥了重要作用 (6)。同时，通过大量临床试验，我们在世界上首次证明了血浆Hsp90α是一个全新的肿瘤标志物。

90-kDa的热休克蛋白（Hsp90）是分子伴侣中一个较大的家族，胞浆Hsp90的存在对于细胞的存活都是必需的 (7)。它作为细胞中重要的分子伴侣，在非应激状态下约占细胞总蛋白的1%，是蛋白平均含量的数千倍 (8)。在肿瘤细胞中，Hsp90的含量可达到细胞总蛋白的2%-7%，所以Hsp90也被形象地称为是肿瘤细胞中众多突变蛋白的稳定剂和缓冲体系 (9)。在肿瘤细胞中，Hsp90能够与多种突变或融合蛋白相结合，维持这些蛋白的稳定性，而这些蛋白大多是在肿瘤恶性转化中起关键作用的激酶和转录因子 (10)。Hsp90在细胞骨架的重排、细胞核蛋白的转运、细胞增殖和凋亡、蛋白降解、抗原呈递、和脂多糖的识别等都具有重要作用。Hsp90还和多种疾病相联系，包括癌症、自身免疫性疾病和心血管疾病等。Hsp90α是Hsp90的一个亚型 (11)。1989年，Weber课题组首次报道了人Hsp90α的全长基因序列，使该蛋白的身份得到了确认 (12)。有文章报道，在恶性黑色素瘤细胞中，Hsp90α的中和性抗体能够抑制黑色素瘤细胞的迁移 (13)。另外，在小细胞肺癌和淋巴癌的细胞表面也观察到肿瘤特异Hsp90α的表达。越来越多的证据表明细胞表面Hsp90α可以作为肿瘤抗原引起机体抗肿瘤免疫反应 (14)。除了在诱导机体免疫反应方面的作用以外，细胞表面的Hsp90α还在肿瘤侵袭中表现出重要的作用。Eustace及其同事发现细胞表面的Hsp90α对于HT-1080成纤维肉瘤细胞的体外侵袭起着关键作用 (15)，另外，一种细胞非渗透性的Hsp90的抑制剂DMAG-N-oxide，对于体外肿瘤细胞（包括膀胱癌、前列腺癌和黑色素瘤）的侵袭以及小鼠体内的肿瘤转移都表现出显著的抑制作用。在小鼠黑色素瘤模型中，DMAG-N-oxide能够抑制肿瘤转移，延长小鼠生存时间 (16)。

Hsp90α不仅在细胞内和细胞表面发挥重要功能，还可以被分泌到胞外。但由于缺乏分泌信号肽，Hsp90α的分泌机制长期以来并不清楚。2009年，我们在世界上首次报道了肿瘤细胞特异分泌Hsp90α的调控机理，揭示了细胞外Hsp90α与细胞内Hsp90α的分子差异，并在肿瘤转移中的功能及其与肿瘤恶性程度的相关性进行了一系列研究 (3)，其中发现Hsp90α的分泌与4个生理过程紧密相关：第一，含有肽重复序列结构域（TPR domain）的蛋白与Hsp90α C末端EEVD基序的相互作用；第二，Hsp90α C末端EEVD的剪切；第三，PKA对苏氨酸90号位点的磷酸化；第四，PP5对苏氨酸90号位点的去磷酸化。另外发现，Hsp90α的分泌是其发挥促肿瘤侵袭作用的前提，使用Hsp90α的抗体阻遏细胞外Hsp90α的活性可以显著抑制肿瘤的转移。我们的研究还发现，细胞外Hsp90α能够在血浆中被检测到，肿瘤病人血浆中Hsp90α的含量与肿瘤的恶性程度，尤其是转移正相关。这项研究经DNA双螺旋结构发现者之一的詹姆斯·沃森的推荐，于2009年发表在PNAS上。该文章也被Faculty of 1000收录并评价说：“该发现为癌症治疗提供了一个潜在靶点。”

基于以上的基础研究，我们与合作单位普罗吉公司共同攻克了一系列技术难题，制备出高纯度、高稳定性抗原标准品和高纯度、高特异性单克隆抗体，进而成功研发出了性能稳定的“Hsp90α定量检测试剂盒” ，并顺利通过中国食品药品检定研究院产品注册检验。该试剂盒的性能稳定表现在如下诸多方面：特异性高，与热休克家族其他蛋白质和其他肿瘤标志物无交叉反应；稳定性好，有效期一年以上；批内精密度和批间精密度的变异系数分别为5%和10%，均优于国家标准。

在此基础上，我们联合中国医学科学院肿瘤医院、军事医学科学院附属医院、北京肿瘤医院、厦门市第一医院、首都医科大学附属北京胸科医院、解放军第三0九医院、上海胸科医院、首都医科大学附属朝阳医院共8家国内知名三甲医院在国际上首次进行了Hsp90α作为肿瘤标志物的临床试验（总样本量2347例）。

在辅助诊断试验中，我们对比了肺癌患者与健康人和肺部良性病变患者血浆样本的Hsp90α含量，计算试剂盒的灵敏度和特异度。同时，我们在平行比对试验中将血浆Hsp90α和其它两种常见的肺癌肿瘤标志物CEA（癌胚抗原）及CYFRA21-1（细胞角蛋白）进行了比较。我们发现在特异度相当的情况下（Hsp90α：90.00%、CEA：89.80%、CYFRA21-1：90.00%），血浆Hsp90α符合率达76.00%，高于CEA（65.81%）和CYFRA21-1（63.85%），这说明Hsp90α诊断准确性更高，是一个性能优越的肿瘤标志物。更重要的是，我们观察到Hsp90α的血浆含量在健康人群（40.32 ng/ml）、肺部非癌病变患者（58.58 ng/ml）、肺癌早期患者（111.50 ng/ml）和晚期患者（251.38 ng/ml）中有明显差异，肺癌不同发生和发展阶段之间有良好的区分度，这表明Hsp90α与肺癌发生及进展有良好的相关性。由以上的数据，我们不难看出肺癌早期患者血浆中Hsp90α含量分别是肺部非癌病变和健康人的2倍及2倍以上，这更能说明它可以有效区分健康人群、肺部非癌病变和肺癌早期患者，极有可能用于肺癌的早期辅助诊断。

在疗效监测试验中，我们对手术和内科治疗的肺癌患者血浆中Hsp90α含量进行动态监测，检验其浓度变化与患者病情变化的相关性。我们发现肺癌患者手术后血浆中Hsp90α水平较手术前有显著性的降低，说明Hsp90α与肿瘤负荷有正相关性。内科疗效监测试验结果显示：患者血浆中Hsp90α水平的变化与患者病情的变化具有对应性，且当Hsp90α检测值变化率大于34%时，指导结果最准确。

Hsp90α定量检测试剂盒临床研究成功证明了Hsp90α是肺癌相关肿瘤标志物，可用于肺癌患者病情监测和疗效评价，是一个全新的肿瘤标志物。Hsp90α定量检测试剂盒已于2013年获得国家食品药品监督管理局颁发的第三类（最高类别）医疗器械证书，用于肺癌的疗效检测和辅助诊断，并于同年通过了欧盟CE认证，获准进入中国和欧盟市场。这是人Hsp90α被发现24年来，全球首个将其用于临床的产品，对于提高肿瘤患者的病情监测和疗效评价水平、实现肿瘤个体化治疗具有重要推动作用。