博士解读 | DNA复制时间直接调节致癌染色体易位的频率

导读

原癌基因的染色体易位可以通过解除对基因表达的调控来促进肿瘤发生发展。染色体易位由两条染色体上产生的DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）的连接形成。目前，DSBs 形成和及其断裂位点连接的潜在调控机制仍待研究。2022年9月奥地利分子病理学研究所Rushad Pavri团队在Science杂志上发表了题为DNA replication timing directly regulates the frequency of oncogenic chromosomal translocations的文章，发现DNA复制时间是调控致癌性染色体易位的频率的关键（Science. 2022 Sep 16;377(6612):eabj5502. doi: 10.1126/ science.abj5502）。

研究结果：

在抗原激活B细胞后，B细胞快速增殖并通过突变和重排免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）基因，使抗体库多样化，最终导致抗体成熟。在这一过程中，DNA修复途径会处理激活诱导脱氨酶（Activation-induced deaminase, AID）会诱导的错配而在Ig基因上产生DSBs。此外，AID也会导致原癌基因MYC和BCL6发生突变产生DSBs，并与Ig基因之间产生易位。MYC和Ig易位是大细胞B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤和伯基特淋巴瘤的典型特征。

已有研究表明，微小染色体维持（Minichromosome maintenance, MCM）复合物表达降低会通过增加复制应力介导的基因组不稳定性从而导致肿瘤发生。研究者发现，在激活的CH12和原代B细胞中敲低Mcm6后，Myc-Igh易位显著减少（图1A, B）。并且AID依赖性易位点富集在MCM敏感的复制起始区域（图1C-E）。

图1

接下来，研究者对Myc起始c13和c23位点分别进行删失突变（图2A），发现突变后的Myc^ΔORI c13和Myc^ΔORI c23细胞中，Myc-Igh易位频率显著减少（图2B, C）。研究者认为，在Myc-Igh易位频率减少的情况下，推断DSBs也应该是减少的，考虑引入外源性DSBs或许能够挽救易位频率。因此，研究者向突变细胞内转染小引导RNA（Small guide RNA, sgRNA），发现实验组Myc-Igh易位频率几乎没有增加（图2D-F）。这一结果排除了这种易位是由相邻染色体的随机相互作用驱动的。结果提示，Myc启动区域调控着DSBs下游的易位频率，但前者并不依赖后者来调节易位的发生。

图2

紧接着，研究者对Myc^ΔORI c13细胞、Myc^ΔORI c23细胞、敲除Mcm6的细胞及其对照进行LAM-HTGTS检测（图3A-C）。发现几乎所有依赖AID的热点都观察到了易位频率减低（图3A-C），其中转录有关的Igh基因包括Ighm、Igha、Igh2b是对照组细胞中最强的热点（图3D-G）。研究者得出结论，Myc的复制起始活性直接调控DSBs形成下游的全基因组AID依赖的易位频率，且独立于DSB的频率。

图3

确定Myc局部复制起始位点活动在Myc易位中的直接作用后，研究者进一步寻找潜在调节机制。复制原点的激活被认为是在一个三维空间中相邻原点集中共同启动[6]。由于这一事件涉及到复制起源位点在空间邻近性，研究者假设AID靶基因中相邻起源的共同复制时间（Replication timing, RT）会导致这些起源位点附近的DSBs的共同定位。根据假设，研究者预测：1、AID靶基因在野生型细胞中具有相似的RT；2、敲除Mcm6的细胞中AID靶基因RT发生改变；3、Myc^ΔORI 细胞RT改变；4、Myc^ΔORI 细胞中Myc-Igh物理接近度降低。

研究者进行Repli-seq检测RT，发现对照组和Myc^ΔORI 细胞显示出明显且基本不重叠的早期和晚期结构域（图4A-C）。然而，在敲除Mcm6的细胞中失去了早期RT，整个S阶段以不协调的方式复制（图4C）。而Myc^ΔORI 细胞中出现了一个新的复制域，结果提示该复制域是由邻近的早期RT域产生的复制叉被动复制（图4D）。可见，Myc复制起点的活动对于建立早期RT至关重要，并与调节染色体易位频率密切相关。研究者进一步发现RT和基因组区室化是独立的过程，AID依赖性易位的减少与基因座结构的总体改变无关（图4E-H）。

图4

研究者假设恢复Myc^ΔORI 细胞等位基因的RT能够挽救Myc的易位频率。因此，研究者将删失的800 bp大小的复制起点片段插入Myc^ΔORI等位基因下游约14 kb的基因位点，该区域位于晚期复制区内，称Myc^ΔORI rest细胞（图5A）。Reli-seq结果显示，Myc^ΔORI rest细胞中早期RT完全恢复（图5B），并且Myc的易位频率也得到挽救（图5C, D）。这些结果进一步证实，早期RT可以调控Myc^ΔORI 细胞中的易位频率。

图5

研究者假设Myc和Igh共享RT驱动他们的接近，并促进DSBs的定位。研究者进一步发现，与对照组细胞相比较，敲除Mcm6及Myc^ΔORI 细胞Myc-Igh相互作用频率则显著降低，并且在Myc^ΔORI rest细胞中这种相互作用频率得到恢复（图6A-C）。最后，研究者进一步挖掘临床意义，发现基因座的同步早期RT能够调控人类B细胞和非B细胞中致瘤性易位的发生，例如人白血病K562细胞中与白血病相关的AF4-MLL1易位频率和与B淋巴瘤相关的BCL6-IGH易位（图6D-H）。

图6

结论：

1、基因座共享早期RT在调控AID介导的易位中起到非常重要的作用，并且调节DSBs形成后和连接前的分子机制。

2、相邻染色体上的复制起点早期RT聚集后同步激发，原点近端的DSB会物理性接近并触发易位。

3、早期RT与人类基因致瘤性易位的发生有关。