张运：动脉粥样硬化研究的当前问题

    进入本世纪以来，动脉粥样硬化（AS）性心血管疾病已成为严重危害人类健康的第一位杀手。AS是以进行性脂质沉积、纤维组织增生和炎性细胞浸润为特征的累及全身大、中型弹性和肌性动脉的慢性疾病。病理学研究证明，主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉和下肢动脉是AS的易患部位。因此，AS是导致冠心病、脑梗死、腹主动脉瘤、慢性肾病和间歇性跛行的共同的病理学基础。近30年来，随着分子生物学、流行病学、循证医学和预防心脏病学的快速发展，人们对于AS发生机制的认识不断深化，针对AS的诊断和治疗技术日新月异，AS性心血管疾病的死亡率已开始显著下降。尽管如此，我们对于AS这一复杂疾病的认识仍处于初期阶段，在这一领域中仍存在着下列亟待解决的问题：

1．AS的病因、危险因素和生物标记物：近年来，AS新型生物标记物的增多和对危险因素的成功干预，导致了人们对于病因、危险因素和生物标记物这三个基本概念的混淆。病因（etiology）是指导致疾病的原因，消除病因可治愈疾病，但AS的病因至今不明，一般认为AS是一个遗传和环境因素相互作用的多因素疾病。危险因素（risk factor）是指可增加发病危险的因素，与疾病有因果关系，且应满足下列条件：（1）在不同人群中该因素与疾病均呈独立、分级和连续相关，随着该因素水平的上升，疾病发生率增加；（2）该因素发生在前、疾病发生在后；（3）降低该因素水平能降低疾病的发生率^[1]。吸烟、高脂血症、高血压、年龄、糖尿病是AS的传统危险因素，但不是AS的病因，因为相当一部分AS患者可无上述危险因素，反之，具有上述危险因素的人群中相当一部分人并无AS。近年来，由于强效他汀类药物的出现，人群中LDL-C水平降低的幅度与心血管病死亡率呈直线负相关，这萌生了 “LDL-C是AS的病因”、“LDL-C水平越低越好”等错误观点，这些观点忽略了LDL-C仅是AS主要危险因素之一的事实。给予ApoE或LDL受体剔除小鼠高脂喂养的同时，抑制LDL-C与管壁基质的结合或抑制单核细胞从管腔向管壁的游移或抑制巨嗜细胞对LDL-C的摄取，AS病变可显著减轻，表明LDL-C水平升高是AS产生的必要条件但非唯一条件^[2]。生物标记物（biomarker）是指反映疾病变化的因素，该因素与疾病呈独立、分级和连续相关，但与疾病无因果关系。Hs-CRP是近年来报告的反应斑块炎症的生物标记物^[3]，但与AS的因果关系尚缺乏前瞻性干预的证据。鉴于新的生物标记物不断涌现，晚近美国心脏病协会（AHA）发布了新型生物标记物的评价标准，这有助于生物标记物的规范应用^[4]。

2．AS的遗传因素和环境因素：美国费明翰心脏研究发现，有早发心血管病家族史（父亲<55岁发病，母亲<65岁发病）的后代中患心血管病的危险较无家族史者增加2倍以上，即使将后代本身的多个危险因素调整后仍是如此。这表明AS性心血管病的发生具有遗传学基础^[5]。由于AS是一个遗传和环境因素相互作用的多因素疾病，仅仅研究和干预AS的环境因素是不够的。近年发展起来的全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）已发现了多个与AS发病相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNPs），其中位于9p21染色体区域的一组SNPs已在白种人、中国汉族人^[6]、东亚人、南朝鲜人、西班牙人、意大利人证实与冠心病发病相关，尤其是在白种人中，杂合子的冠心病发病危险增加约20%，而纯合子增加约40%^[7,8]。然而，综合已发表的研究，冠心病易感SNPs增加发病危险的OR值一般小于2.0，与传统的费明翰危险因素计分相比，C统计值或ROC曲线下的面积并无显著差异。因此，美国心脏病学会和协会（ACC/AHA）目前不建议在无症状人群中进行SNPs的大规模筛查^[9]。尽管如此，新兴技术如GWAS精细测序、DNA外显子测序、mRNA测序和全基因组测序的发展将有助于发现更多的AS易感位点，有助于在AS危险因素出现之前更早地预测心血管疾病和阐明AS的发生和发展机制，DNA甲基化的研究将有助于阐明AS的遗传因素及其与环境因素的相互作用，药物代谢SNPs的研究则有助于检出心血管药物疗效不佳者，从而推动临床医学从循证医学走向个体化治疗。因此，AS的遗传学研究方兴未艾。

3．AS病变的血管床选择性：AS的传统危险因素对人体的影响是全身性的，但AS病变只发生在动脉系统而不发生在静脉系统，将静脉移植到动脉系统（如冠脉搭桥术）后血管壁组织逐渐动脉化，最终发生AS病变。在动脉系统内，AS常累及主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉和下肢动脉，但对于其他血管床很少累及。在受累血管床中，病变仅出现于大中动脉而不出现于小动脉，西方人常出现冠状动脉病变，而东方人常出现脑动脉病变。这些现象提示，AS病变具有明显的血管床选择性。近年研究发现，AS病变的血管床选择性受到血流动力学的显著影响。血流的低剪切力可增高血管内皮的通透性，激活血管内皮细胞表达炎性因子。在ApoE-/-小鼠颈动脉放置狭窄套管的第2天，套管近端的血流剪切力降低，血管内皮细胞表达MCP-1增多，内膜通透性增加，7天后血管内皮下巨嗜细胞和脂质增多，内膜开始增厚，表明血流的低剪切力与AS早期病变之间存在因果关系^[10]。研究发现，血管内皮细胞的力学-生物学信号偶联（mechano-biological signaling coupling）涉及多条信号转导通路，阻断这些信号通路有可有效减轻血流低剪切力导致的AS早期病变^[11]。然而，血管内皮细胞的力学-生物学信号偶联只能部分解释上述AS病变的血管床选择性，在这一领域中仍有待于更深入的研究。

4. AS发病机制的网络观和动态观：在长达几十年的人类AS病程中，血管壁细胞受到多种遗传和环境因素的影响，数以百计的基因被激活，合成和释放大量的细胞因子，产生多种多样的生物学效应。因此，AS的发病机制涉及到极其复杂和庞大的细胞内信号转导网络，包括血管发育、炎症-免疫、凋亡-自嗜、细胞增殖、血管新生、氧化应激、血管老化等^[12]。为了有效干预AS的发生和发展，仅仅选择网络中的一个或几个分子是远远不够的，应寻找关键分子或调节结点，以图 “纲举目张”。 我们的研究证明，细胞膜表面的Toll受体亚型1， 2， 4介导了AS的炎症过程，联合沉默Toll-1和Toll-2对于斑块炎症仅有相加作用，而联合沉默Toll-2和Toll-4则有协同作用，这是因为Toll-1和Toll-2共用同一细胞内信号通路，而Toll-2和Toll-4 则利用不同的信号通路，这个例子说明了网络干预的重要性^[13]。此外，在AS长期的发展过程中，某个网络可能仅在某个时期起作用。在不同的时期，血管壁细胞可能起到“双刃剑”的作用。例如，在AS早期，内膜增厚是病变，但在AS晚期，内膜增厚有助于增厚纤维帽和稳定斑块。同样，在AS早期，血管平滑肌细胞的游移和增殖可增大斑块，但在AS晚期，血管平滑肌细胞的游移和增殖却可加固纤维帽，预防斑块破裂。巨嗜细胞吞噬内皮下的脂质有助于缩小斑块体积，但巨嗜细胞的聚集可加重斑块炎症。因此，在研究AS的发病机制、测量指标和干预措施时，应特别注意AS发病机制的网络观和动态观。

5．AS病程的非线性和可逆性发展：传统的观点认为，AS是一个进行性和直线性的发展过程。随着现代影像学技术和有效干预手段的问世，人们已认识到，AS实际上是一个可逆性和非线性的发展过程。由于AS斑块的增生、静止、缩小、损伤、破裂、修复、再损伤、再破裂、再修复等病理过程，临床可表现为无症状性冠心病、稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、无ST段上抬型急性冠状动脉综合征（ACS）、ST段上抬型急性心肌梗死以及这些临床综合征的交替出现。影响AS斑块病理变化的因素包括：血脂水平、内皮结构和功能、内皮祖细胞修复能力、全身和局部炎症、纤维帽胶原合成和降解速率、坏死核的大小、新生血管密度、斑块内出血、他汀治疗等^[14,15]。对AS病程进展的新认识提示：（1）明确、检出和避免导致斑块破裂的危险因素，有可能预防急性心血管事件的发生；（2）少数患者冠状动脉斑块的迅速增大可能与无症状性斑块破裂和修复或斑块内出血有关，因此，这些患者需要积极干预，以避免严重心血管事件的发生；（3）积极控制危险因素和规范进行他汀治疗，斑块的大小和性质是可逆的——可由大斑块演变为小斑块，由易损斑块演变为稳定斑块，由破裂斑块演变为修复斑块；（4）在评价某种治疗方法的疗效时，应采用随机对照的大样本临床试验并进行长期随访，以排除病程本身变化的影响。

6．AS动物模型的发展：与人体的其他组织不同，人体的动脉是不可能取活检的。因此，有关AS的组织学研究基本依赖动物模型，这造成了AS基础研究的困难。大动物如猴子和猪与人类同属杂食类动物，心血管系统和脂质代谢亦相似于人类，在这些动物中长期喂养高脂饲料或敲除LDL受体基因可在主动脉和冠状动脉形成AS斑块，与人类病变非常相似。然而，价格昂贵、喂养时间长、动物体积大、伦理非议多等问题极大地限制了这些动物模型的发展。相反，新西兰兔、ApoE-/-小鼠或LDLR-/-小鼠价格便宜、喂养时间短、动物体积小、伦理非议少，已成为目前AS研究的主要动物模型。由于小鼠AS斑块与人类非常相似且小鼠基因序列已知，可进行基因敲除或基因敲入，故已成为应用最广泛的AS动物模型。然而，小动物模型存在以下限制性：（1）AS斑块主要出现在主动脉及其分支，冠状动脉和颈动脉内不出现斑块；（2）兔子的AS斑块主要为纤维增生性病变，不同于人类的脂质性斑块，且兔子的基因序列不知，基因干预困难；（3）兔子和小鼠的AS斑块均为稳定性斑块，几乎不发生斑块自发性易损和破裂^[16]。近年来，本实验室应用高脂喂养、内皮损伤、基因转染、精神应激、药物触发等方法，成功地在新西兰兔和ApoE-/-小鼠中建立了斑块易损、出血和破裂的动物模型，获得了国际学术界的认可，为易损斑块的基础研究提供了适宜的研究对象^[17,18]。尽管如此，目前AS动物模型的研究周期通常短于20周，在这样短暂的时间内所得出的发病机制，用于描述长达几十年的人类AS发病过程，其限制性是不言而喻的。此外，涉及AS发生和发展的小动物各个系统的功能与人类差别甚大，在小动物体内反复证实的氧化、炎症和免疫等AS发生机制在人体AS病变中至今缺乏令人信服的证据^[19]。因此，将小动物实验中得出的结论外推至人类时，需要特别的慎重。发展价格适宜、喂养时间短、与人类病变相似的大动物模型已势在必行。

7．AS的形态和功能显像：为了检出、干预和随访AS病变，需要发展准确、简便、安全、价廉的AS显像技术。在无创伤性显像技术中，颈动脉超声测量的IMT已成为评价抗AS药物疗效的最常用的临床试验中间终点。然而，体表超声、多排CT、磁共振的空间分辨率均较低，无法显示斑块的坏死核和纤维帽，难以对斑块性质做出判断。在创伤性技术中，血管内超声（IVUS）可显示斑块面积、狭窄程度、血管重构以及斑块的脂质、纤维化和钙化成分，但不能显示变薄的纤维帽。第二代光学相干断层显像（OCT）可准确显示纤维帽的厚度和断裂、斑块面积、以及斑块的脂质、纤维化和钙化成分，但不能显示斑块炎症。为了显示斑块的炎症程度和坏死核的大小，近年来发展了AS的功能显像技术。由于弹性可反映组织的成分，本实验室建立了基于IVUS的血管二维和三维弹性图以及基于斑点跟踪技术的斑块表面应变测量方法，利用这些技术可准确预测实验动物的斑块破裂^[20,21]。新近发表的PROSPECT研究发现，IVUS 在ACS患者所检出的非罪犯血管的斑块负荷>70%，最小管腔面积<4.0mm²以及薄帽纤维粥样瘤，可独立地预测3年内非罪犯血管所导致的急性心血管事件^[22]。利用纳米或单克隆抗体技术将导致斑块炎症的分子如VCAM-1,ICAM-1,MMPs或巨嗜细胞坏死后释放的分子如组蛋白等与核素、CT、MRI或超声等影像技术的显影剂相结合可显示斑块的炎症程度或坏死核大小，从而可对斑块的易损性做出评价。这些功能显像技术的发展将为AS病变的早期检出和危险评估提供新的手段^[23]。

8．AS的药物和基因治疗：AS是全身性疾病，局部狭窄病变的介入或手术治疗虽可缓解组织缺血但无法改变AS的病程。他汀是AS药物治疗的基石，其主要作用是降低血清LDL-C水平，但其抗炎作用日益受到重视。我们的研究证明，他汀快速抗炎的主要机制是抑制内皮细胞TLR-4受体的表达及其下游信号通路蛋白的磷酸化，从而导致NF-κB活性的抑制^[24]，这种抗炎作用独立于调脂作用。因此，对于慢性冠心病他汀主要通过调脂发挥疗效，而对于ACS他汀主要通过抗炎发挥疗效，在分析以心血管事件为终点的他汀治疗的临床试验时，应充分考虑到他汀调脂和抗炎的双重作用。近年临床试验的结果表明，ACS患者即使服用大剂量他汀，心血管事件的残余危险仍高达22%^[25]，说明需要发展新的治疗药物。胆固醇酯转移蛋白（CETP）阻滞剂可升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），后者可加强胆固醇从组织向肝脏的逆向转运，从而减轻斑块炎症，两种新的CETP阻滞剂dalcetrapib和anacetrapib已进入临床试验，后者已证明具有良好的安全性。本实验室的系列研究证明，过表达ACE2、PPAR-γ1、HO-1等基因或抑制MCP-1、TLR1、TLR2、TLR4、糜酶等基因的表达可显著减轻斑块炎症和稳定斑块但不影响脂质代谢^[26,27]。同样，抑制脂蛋白相关的磷脂酶A2（Lp-PLA2）可抑制斑块炎症，目前Braunwald教授领导的SOLID-TIMI 52试验正在大样本的人群中检验Lp-PLA2抑制剂darapladib稳定斑块的作用。由美国国家心肺血研究所领导的CIRT试验旨在检验小剂量氨甲蝶呤对于心肌梗死患者再发心血管事件的影响^[19]。我们的研究证明，在易损斑块的动物模型中，中药通心络具有稳定斑块的作用，目前一个由本实验室领导的检验通心络对于颈动脉IMT影响的全国多中心随机双盲临床试验（CAPITAL试验）正在进行中。这些新的临床试验将为AS的治疗开辟新的途径。

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