单细胞研究指南：测序方法大比拼
2016-05-18 佚名 Ebiotrade
多细胞生物的每个细胞都携带着相同的遗传学信息。不过，近年来蓬勃发展的单细胞研究告诉我们，每一个细胞都是独一无二的。The Scientist杂志最近联系了单细胞研究领域的一些专家，请他们分享了在单细胞中进行转录研究的秘诀。希望帮助研究者们更好地构建文库，处理和分析结果数据。那么，细胞之间的哪些差异有生物学意义，哪些差异来自于技术偏好呢？要获得可靠的结果又需要研究多少细胞呢？这些问题曾经是单细胞
多细胞生物的每个细胞都携带着相同的遗传学信息。不过，近年来蓬勃发展的单细胞研究告诉我们，每一个细胞都是独一无二的。The Scientist杂志最近联系了单细胞研究领域的一些专家，请他们分享了在单细胞中进行转录研究的秘诀。希望帮助研究者们更好地构建文库，处理和分析结果数据。
那么，细胞之间的哪些差异有生物学意义，哪些差异来自于技术偏好呢？要获得可靠的结果又需要研究多少细胞呢？这些问题曾经是单细胞研究（尤其是单细胞转录组研究）的拦路虎，令人望而却步。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞数据分析工具在这方面为人们提供了很大的帮助。
The Scientist杂志最近联系了单细胞研究领域的一些专家，请他们分享了在单细胞中进行转录研究的秘诀。希望帮助研究者们更好地构建文库，处理和分析结果数据。
测序方法大比拼
在单细胞研究的大潮中，新的测序方法层出不穷。不过，很少有人对这些方法进行系统的比对。慕尼黑大学生物学家Wolfgang Enard最近领导团队，在小鼠胚胎干细胞的基因表达研究中比较了一些常用的单细胞测序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一个具有里程碑意义的重要技术。实际上，能够从单细胞生成全长cDNA的测序方案并不多，Smartseq就是其中之一。对于等位基因特异性表达或者剪接变体研究来说，覆盖整个转录组是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1单细胞制备系统能够自动完成Smart-seq步骤。你只需要将制备好的细胞悬液加进去，仪器就会分离并裂解细胞，把mRNA逆转录为cDNA，再对cDNA进行扩增。扩增后的cDNA可以拿来测序，也可以进行qPCR检测。
在Enard的比较研究中，Fluidigm C1系统的Smart-seq最为灵敏，成本也最高。这一系统使用的微流体芯片不能重复使用，不过这种芯片可以放到显微镜下观察，证实健康单细胞的存在。
斯坦福大学的著名学者Stephen Quake及其团队利用Fluidigm C1单细胞制备系统，对人类大脑皮层的482个单细胞进行了高通量转录组测序，最终得到了466个单细胞的RNA测序数据。数据分析表明，单细胞测序结果不但能用于区分神经元、神经胶质细胞以及血管细胞，还能将神经元分为五类兴奋性细胞和两类抑制性细胞。
CEL-seq
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一种采用线性扩增的常用测序方法。线性扩增的主要优势是错误率比较低，不过线性扩增和PCR都存在序列依赖性偏好。
CEL-seq技术发表于2012年，主要是分离单细胞，逆转录带有poly-A 尾巴的mRNA片段，给它们贴上代表其细胞来源的条码。2014年Science杂志发布的MARS-seq与CEL-seq很类似。
CEL-seq和其他线性扩增方法生成文库花费的时间要稍微长一点。不过，CEL-seq在早期阶段就给样本贴上条码并进行混合，大大减少了手动操作的时间。PCR是在最后阶段使用的，主要是为了连接正确的测序接头，CEL-seq开发者纽约大学的Itai Yanai介绍到。
CEL-seq所需试剂都是现成的，大约两天时间生成测序文库和测序数据，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq与大多数方案一样，测序转录本的3’ 端。Enard等人并没有亲自尝试着一技术，只是在比较研究中用到了CEL-seq数据。从这项研究来看，CEL-seq的重现性最好。GitHub网站提供有CEL-seq可用的生物信息学工具。Yanai研究团队正在开发新版本CELseq2，新版本的灵敏度将比旧版本高三倍。
SCRB-seq
Broad研究所开发的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技术采用的是PCR扩增。该技术需要结合流式细胞仪（FACS）或者其他细胞分选方法，把单细胞分配到微孔里去。
SCRB-seq与Smart-seq比较相似，只不过SCRB-seq会整合特异性的细胞条码，以分辨扩增分子的来源，更准确的定量转录本。此外，SCRB-seq并不生成全长cDNA，而是像CELseq一样富集RNA3’端。
2014年，开发者们将SCRB-seq技术提前发布在BioRXiv上。随后他们对这一技术进行了更新，并将其更名为“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技术服务，SCRB-seq也被整合到了WaferGen Biosystems公司的scRNA-seq平台上。
据说Fluidigm公司的C1系统很快也将支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的测序方法，它不仅适用于单细胞RNA测序，还能支持大量细胞（bulk）的RNA测序。可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很难将测序流程与FACS对接起来。
目前，在单细胞中揭示DNA甲基化与基因表达的直接关联还比较困难。这是因为细胞之间存在较大的差异，又不能同时检测一个细胞的转录组和甲基化组。加州大学范国平教授和同济大学薛志刚教授在5月5日的Genome Biology杂志上发布了自己开发的新测序方法——scMT-seq。这种方法能够同时分析单个细胞的转录组和甲基化组。
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这篇资讯带给我们新知识，启发新思维，不论是科研还是临床工作都有很大的帮助。。。
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