加州大学河滨分校Maurizio P.小组JMC：聚焦组合文库核磁共振筛选在抗凋亡蛋白hMcl‑1药物研发的应用

在基于片段药物发现中，溶液核磁共振波谱无疑是命中验证和命中识别最可靠的生物物理方法之一。药物研发实验室非常依赖蛋白质核磁共振波谱策略来验证使用其他技术发现的苗头化合物。近年来，也有许多其他方法被开发出来用于寻找靶标蛋白的配体分子如：基于干涉测量的方法，基于质谱的策略，热力学测量，变性热位移测量，甚至高通量结晶，等等。然而，多年来，这些新兴策略在可靠性上都不如蛋白质核磁共振波谱。但是，与其他筛选策略相比，核磁共振筛选策略目前仍存在一个较大的短板——通量较低。这一限制使得核磁共振仅限于筛选小的化合物库，通常仅限于几百个化合物。

加州大学河滨分校医学院Maurizio Pellecchia小组针对这一问题，报道了一种创新的配体发现策略，该策略基于蛋白质核磁共振筛选技术，利用独特的文库构建方式不仅提高了核磁共振筛选技术的通量并且在BCL-2家族蛋白hMCL-1新型抑制剂的开发中检验了其应用价值。近日，该项研究工作发表在美国化学会出版的药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry期刊上（J. Med. Chem. 2023, 66 (14), 10108–10118）【1】。

溶液核磁共振波谱由于其灵敏性高使其成为基于片段药物发现中命中验证和命中识别最可靠的生物物理方法之一。而该策略明显的缺点是核磁共振实验固有的低通量。近年来，Maurizio Pellecchia课题组提出以单位点扫描(Positional Scanning，POS)方式制备化合物库，使核磁共振在筛选活动中与其他筛选策略在吞吐量和化学空间取样方面不相上下。该课题组报道了一种新的三肽样组合化合物文库，设计用于基于核磁共振的筛选，它由大约125,000个化合物组成，排列在96种混合物中，每种混合物含有~ 1300（36*36）个分子片段。每种混合物的分子片段的特征是一个共同的N-端片段偶联到所有可能组合的二肽，这些二肽来自选定的36种天然或非天然氨基酸。

为了阐释该明文库的合成以及优化后可以命中更多的类药分子，该课题组设计合成了一个新的化合物文库和相关的反卷积建库策略。同时，为了减少这些片段分子的肽样性质，文库中的第一个分子片段均含有磺酰氯官能团，使用常规固相合成方法与二肽混合物(在天然和非天然胺酰胺中选择36 × 36)的每个分子片段的N-端反应制备获得目标产物。之所以选择含有磺酰氯片段是由于其与伯胺有较高的反应性。当然，作者同时指出，可以根据情况需要选择其他反应，建立不同的库，从而实现库的扩展。在实验中，该课题组选择了96种含有磺酰氯的不同片段，并使用常规平行固相合成方法将每种磺酰氯偶联到树脂上的36 × 36二肽混合物中。图1给出了库的示意图，包括三个部分，P1(磺酰氯化合物集合)、P2和P3均为36种天然或非天然氨基酸集合，图中还给出了库的关键物理-化学性质。

图 1基于混合物的核磁共振筛选组合库构建、性质及最终分子示意图

设计靶向蛋白-蛋白相互作用(Protein−Protein Interactions，PPIs)的有效和选择性配体仍然是药物发现中最具挑战性的任务之一，尽管PPIs是目前具有最广泛可行性的治疗靶点之一。有趣的是，FDA批准的唯一合理设计的靶向PPI的药物是BCL-2靶向抑制剂Venetoclax，该药物是通过核磁共振筛选并经过后续大量的基于结构优化得到的。虽然初始命中片段(低亲和力的低分子量分子)通常可以用核磁共振筛选获得，但将其优化为高效和高选择性的药物仍然是一个巨大的挑战。因此，若能开发出有效地迭代地监测配体结合，并且提供有关相对结合亲和力、脱配率或诱导构象变化的定性信息的技术手段是非常有意义的，这项技术的获得对于PPI分子抑制剂的研究也将意义非凡。

该课题组将新开发的方法——核磁共振高通量筛选法（High-throughput Screening NMR,HTS-NMR）应用于BCL-2家族蛋白中hMCL-1蛋白结合小分子的筛选、反卷积和初始优化。该方法结合了单位点扫描组合化学和基于蛋白质核磁共振筛选原理，在具有10万个化合物的文库中筛选可能的蛋白质-蛋白质相互作用初始结合配体。与此同时，该课题组还引入之前提出的“聚焦”单位点扫描文库核磁共振高通量筛选方法( “focused” positional scanned library ,fHTS by NMR)，该文库中的每个分子片段都由具有特定目标(或特定目标类)的结合片段派生。此方法的有效性已在蛋白EphA4配体的筛选识别和后续优化中获得了验证。并且采用一种灵敏且不容易出现假阳性的无标记NMR结合试验——通过观察靶点蛋白 (hMCL-1)一维氢谱(1D 1H) 1ppm位移以下脂肪区信号有无来判别蛋白-化合物有无结合。

在针对靶蛋白hMCL-1配体的筛选实验中。该课题组将96种磺酰氯混合物暴露在hMcl-1 蛋白中，通过收集并分析不同混合物对一维核磁氢谱图中脂肪族区域信号扰动大小，从而对磺胺组合库P1进行筛选并排序，根据实验结果最终从P1文库中选定E07和E11两个片段，接着继续筛选P2和P3部分的优势片段。筛选过程最终收敛于化合物12。这一结论同样被等温滴定量热法证实。随后，该课题组利用构效关系对化合物12进行了一系列优化，获得了数据更好的化合物50，并对其结合构象做了进一步探索（相关结果如图2所示）。

图 2优化后化合物50的结构及相关测试数据

综上所述，使用这种相对简单的排序方法，既可以保留核磁共振筛选法的灵敏度，又能提高其筛选通量，极大地扩展了核磁共振筛选法的适用性。

本文介绍了识别靶向PPIs的新方法，包括高通量核磁共振筛选方法中使用单位点扫描，以及聚焦高通量核磁共振筛选方法(f HTS by NMR)。这两种发方法均可以对PPIs的活性配体进行从头鉴定。同时本文还并提出了一种更简单的基于混合物的建库方法，该方法可以更直接、更实际地制备大型化合物库，这些库适用于基于蛋白质的NMR方法进行筛选和反卷积策略，并且此方法不容易出现假阳性。利用该方法Maurizio Pellecchia课题组最终获得了具有较好结合力的、新型靶向hMCL-1的化合物骨架。该方法相对简单，可以在各种场景中找到普遍的适用性，包括环状肽库的构建以及针对蛋白初始结合骨架的优化。

参考文献

【1】Giulia Alboreggia, Parima Udompholkul, Carlo Baggio, and Maurizio Pellecchia*, Mixture-Based Screening of Focused Combinatorial Libraries by NMR: Application to the Antiapoptotic Protein hMcl‑1, J. Med. Chem.2023, 66 (14), 10108–10118.