Preprints: 利用对外源性RNA的转录反应预测RNA病毒的广谱抗病毒药

所有RNA病毒都通过与正常运输细胞RNA转录本不同的过程将其基因组传递到目标宿主细胞中。来自正常的细胞RNA转录的运输。病毒RNA的传递最多。进入大多数细胞的病毒DNA的运输因此触发了先天的抗病毒防御机制，将病毒RNA识别为异物。反过来，病毒已经进化出了破坏这些防御的机制，让它们在其中茁壮成长。此外，药物激活防御能够作为广谱抗病毒药物对外源性RNA来说，研究人员证实了与细胞对非病毒的外源性RNA序列传递的反应相关的转录应答可以预测具有广谱抗病毒活性的小分子。

特别是将Cas9m RNA传递到人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的转录反应与具有广谱抗病毒作用的小分子触发的转录反应高度匹配。 艾美汀、高阿灵顿碱、帕莫果酸吡嗪和山莨碱等活性药物，表明这些药物对其他RNA病毒具有潜在的活性。此外，这些药物已被批准用于其他适应症，并有可能被用于新的病毒。此外，这些药物已被批准用于其他适应症，因此可能用于新病毒。因此，研究人员认为这些抗病毒活性应被确定为针对sars-cov-2的药物，因为它们已被证明对其他冠状病毒有效，包括sars-cov和mers-cov。这些药物可能也可作为潜在的佐剂开发中的COVID-19疫苗。由于它们对先天抗病毒防御系统的潜在影响可以增强适应性免疫。

获得性免疫是由高度特化的细胞类型驱动的B细胞和t细胞，对病毒感染的先天免疫几乎被所有的细胞类型所拥有。与获得性免疫不同，获得性免疫涉及抗原特异性受体通过基因重组、先天防御来抵御各种依赖于生殖系编码模式识别受体(PRRs)的病毒。PRRs的抗病毒防御识别特定病原体相关的分子模式(PAMPs)是对病毒复制和传播至关重要的，例如病毒核酸，因此目标病毒很难改变。然而，许多病毒绕过了这一挑战通过瞄准prp。因此，激活单个细胞内固有的抗病毒防御可以为开发广谱抗病毒药物提供手段。

在这里，研究人员假设一个外源性RNA序列进入人类细胞，引起抗病毒防御的特征是一种特殊的转录反应，增强这种反应的小分子具有广谱抗病毒的潜力活动。与颠覆天然细胞防御外来RNA的病毒相比，非病毒外源RNA应该唤起抗病毒反应，但不能破坏这些防御。因此，研究细胞对非病毒外源RNA的反应可以为外源RNA防御提供一个公正的观点。使用连接映射数据库成千上万的基因和化学人类细胞系的扰动，我们表明，几个小分子与广谱抗病毒活性引起转录反应非常类似于人类细胞摄动的交付一个外生，合成RNA序列。利用人类细胞系的数千个遗传和化学干扰的连通性图谱数据库，研究人员展示了几个小的具有广谱抗病毒活性的分子可以引起转录反应与那些被外源性合成物干扰的人类细胞非常相似的RNA序列。

外源RNA转录反应与病毒感染的关系

作为细胞对外源性RNA传递反应的代理，研究人员最近进行了研究发表了一种人类细胞对非病毒RNA的转录反应编码cas9蛋白和CRISPR gRNA到血红蛋白B位点(HBB)的序列，以下简称“cas9 mRNA”。特别是cas9 mRNA的传递为造血干细胞和祖细胞(公司)被发现引起强大的抗病毒转录反应。一些基因天生的抗病毒反应如干扰素刺激基因(isg)、干扰素调节因子(IRF1、IRF7 IRF9)和胞质外国RNA传感器RIG-1调节cas9 mRNA交付)。当外源性RNA进入细胞后，先天抗病毒防御被激活。体外转录的CRISPR导rna也有报道(4)。gRNA触发HEK293细胞中干扰素-beta1 (IFNB1)增加30至50倍。50nm gRNA诱导了1000倍的IFNB1，其效果与之相当。由仙台病毒或丙型肝炎病毒PAMP RNA诱导。探讨转录应答的潜在调控机制cas9 mRNA的表达及其与关键抗病毒反应调节因子的关系，研究了所观察到的转录变化与所获得的转录变化之间的相似性。在连接图中，成千上万的基因在不同细胞系中过表达(CMap)数据库，一个超过100万个人类转录特征的概要在成千上万的化学和遗传干扰下的细胞系。有趣的是，研究人员发现，IFNB1的过表达跨越多个细胞系。CMap数据库有一个最类似于传输的转录应答cas9 mRNA，与之前报道的CRISPR gRNAs诱导IFNB1一致。此外，排名前几位的特征是与先天有关的基因对b细胞淋巴瘤样蛋白(BCL2L2)、TNFRFS1A、KLF6等病毒的免疫和TIRAP。例如，b细胞淋巴瘤样蛋白(BCL2L2)的抑制作用。抗癌化合物nt -263能加速A型流感病毒(IAV)感染的细胞凋亡。细胞和降低感染小鼠的存活率(8)；kruppel样因子6 (KLF6)是一种转录在感染期间诱导抗病毒化合物一氧化氮产生的因素。从负意义上讲，单链RNA病毒如IAV(9)或呼吸道合胞体病毒(RSV) ；B维生素a酸介导的抗病毒应答需要BCL10。可诱导的基因1 (RIG-1)，它在细胞溶胶中感受外来RNA，而toll白介素-1域受体(TIRAP)是先天必需的免疫信号的配体，如病毒核酸在多个亚细胞隔间。

转录信号与外源RNA和小分子的相似性

研究人员之前已经证明了不同细胞系中几个小分子的转录特征高度相似与交付CRISPR/Cas9组件是相关的，包括交付的cas9 mRNA序列。已知对cas9 mRNA的转录应答是与抗病毒转录应答有关，研究人员推论出一些小的具有与cas9 mRNA类似的转录特征的分子可以承担广泛的功能频谱抗病毒活性。由于cas9m RNA的传递也可能导致与外源RNA传感无关的转录反应，研究人员过滤掉了转录信号与t高度相似的小分子，将CAS9蛋白与gRNA预复合后传递，形成核糖核蛋白RNP。这一过程去除了依托泊苷、替尼泊苷和依大柔比星等小分子，由于Cas9蛋白表达在诱导DNA裂解中的下游作用，这些小分子可能与Cas9m RNA具有相似的转录效应。值得注意的是，经过这种过滤后残留的顶部小分子包括几种蛋白质合成抑制剂，即普罗霉素、高哈林顿、艾美汀（及其结构类似物塞佩琳）、山莨碱和环己酰亚胺。

广谱抗病毒药物对新型病毒SARS-CoV-2的影响

目前迫切需要确定针对新出现病毒的广谱抗病毒药物感染。尤其是近期出现的SARS-CoV-2病毒及其在世界各地的传播迅速传播。迫切需要迅速开发抗病毒药物和疫苗以预防随后发生的COVID-19的蔓延。为了探讨预测的小分子除了已知的广谱抗病毒作用外，还有抑制SARS-CoV-2的潜力，我们检索了已发表的关于其对SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-229E等其他冠状病毒的潜在活性的文献，挖掘了一个广谱抗病毒药物的公共数据库，并考虑了这些分子是否已被批准用于其他疾病。在最近的一个由2000个已批准和药理活性化合物组成的文库的高通量筛选中，发现埃美汀、帕莫果酸吡嗪和环己酰亚胺在低微摩尔浓度下对冠状病毒MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-NL63和MHV-A59具有广泛的光谱活性。此外，在一个由290个化合物组成的图书馆的单独屏幕上，经FDA批准或先进的临床开发，艾美汀、茴香霉素、环己酰亚胺和羟阿霉素对MERS-CoV和SARS-CoV都有很高的活性。一些广谱抗病毒药物目前正在测试持续的COVID-19大爆发，包括瑞德西韦、氯喹和利托那韦。瑞地西韦(GS-5734)是一种由吉列德科学开发的核苷类似物前药，是一种很有前途的抗病毒药物，已被证明能抑制其他冠状病毒，包括MERS-CoV、SARS-CoV-2在体外和第一例COVID-19患者。氯喹，一种一次性成功的抗疟疾药物，也显示了对SARS-CoV-2和其他病毒的活性。研究人员将这些药物的广谱抗病毒范围与本研究中发现的小分子药物进行了比较。

与正在进行SARS-CoV-2临床试验的瑞德西韦不同，研究人员本研究中确定的药物具有许多优点：

1它们针对的是宿主的抗病毒防御而不是病毒蛋白，因此可能会避免RNA病毒中普遍存在的抗药性的进化。

2它们很可能在几乎没有遗传相似性的病毒间活动，感染不同的细胞类型

3与其他药物只在其扩散的细胞中起作用相比，激活抗病毒防御的小分子可导致抗病毒效应蛋白、细胞因子和趋化因子的分泌，这些蛋白、细胞因子和趋化因子可扩散到其他细胞并吸引/激活特定的免疫细胞。

这些显示了这些药物对不同冠状病毒的活性。除了抗病毒活性外，依米汀也是止咳糖浆中的祛痰剂，并有治疗肺动脉高压的前景。因此，该药可能对有肺部并发症(如COVID-19)的患者有额外的好的作用。

比较cas9 mRNA对小分子的转录反应

研究人员从Cromer等人中获得了CD34造血干细胞(H SPCs)在Cas9m RNA和sgRNA中的差异表达基因。 简单地说，Cromer在Al的研究提供了含有5-甲基胞苷和假尿苷修饰的Cas9m RNA，这些修饰限制了天然免疫反应，而sgRNA具有2‘-o-甲基-3’-磷酸硫代酯修饰，以提高耐受性和活性。利用电穿孔将RNA传递到细胞中。通过计算cas9m RNA处理样品和暴露于模拟电穿孔的样品之间的log2折叠变化来进行差异基因表达分析。研究人员构建了cas9m RNA反应的转录特征，包括前150个上调基因和150个最下调的基因，其截止值为MLogP(即MLogP)。

过滤掉小分子的转录应答可能匹配的cas9 mRNA交付由于下游效应(如mRNA cas9蛋白介导)双链断裂，研究人员也查询提出使用转录应答cas9交付后由基因差异表达蛋白质结合sgRNA针对HBB(核糖核蛋白，RNP)。RNP应答是用与上面描述的cas9 mRNA类似的方法构建，用于查询CMap对于具有匹配特征的小分子。然后排除了小分子应答匹配cas9 mRNA和RNP应答。

广谱抗病毒分析

为了确定预测的冠状病毒小分子的广谱抗病毒潜力，研究人员使用了从2000个化合物的高通量筛选中获得的公共数据290种批准药物的小型图书馆(30种)。研究人员还获得了广谱活性其他病毒的数据来自最近的一项研究及其相关数据库(drugvirus.info)。

原始出处：

Nordor， A.V.； Siwo， G.H. Predicting Broad-Spectrum Antiviral Drugs against RNA Viruses Using Transcriptional Responses to Exogenous RNA. Preprints 2020， 2020030437 (doi： 10.20944/preprints202003.0437.v1).