同时检测天然tRNA丰度和修饰谱,Nat Biotechnol发表基于纳米孔的tRNA直接测序新方法

2023-05-17 测序中国 测序中国 发表于上海

研究团队开发了一种名为Nano-tRNAseq的tRNA纳米孔测序新方法,可直接对天然tRNA进行精确测序,准确定量tRNA丰度并同时捕获tRNA修饰变化。

RNA存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,不同类型RNA具有不同的作用。转移RNAtRNA)在蛋白质翻译中起着重要作用。如果tRNA中发生错误修饰或修饰缺失会产生错误或不完整的蛋白质已有研究发现,多种tRNA修饰酶的突变与各种人类疾病有关,包括神经退行性疾病、代谢疾病和癌症。但是,研究tRNA一直面临着诸多挑战,部分原因是缺乏一种同时量化其丰度和化学修饰的简单方法。因为目前的纳米孔测序设置会丢弃绝大多数tRNA reads,测序产量低,并且基于转录物长度对tRNA丰度的表示差。

近日,来自西班牙巴塞罗那科学技术研究所的研究团队及合作者在Nature Biotechnology发表了题为“Quantitative analysis of tRNA abundance and modifications by nanopore RNA sequencing”的研究论文。研究团队开发了一种名为Nano-tRNAseq的tRNA纳米孔测序新方法,可直接对天然tRNA进行精确测序,准确定量tRNA丰度并同时捕获tRNA修饰变化。研究团队利用Nano-tRNAseq成功检测了酿酒酵母tRNA群同一分子内不同tRNA修饰类型之间的串扰和相互依赖性,以及tRNA群体对氧化应激的反应变化。

文章发表在Nature Biotechnology

牛津纳米孔技术公司(ONT)开发的直接RNA测序(DRS)平台是基于NGS技术来描述tRNA组的一个很有潜力的替代方案。该技术允许对天然RNA分子进行直接测序,因此,原则上可以检测和定量tRNA修饰和tRNA丰度,不需要逆转录或PCR。先前的研究已经证明,纳米孔可以使用固态或生物(ONT)纳米孔捕获tRNA。通过连接接头来延长tRNA分子,tRNA可以通过生物纳米孔进行测序、基础标记和定位。但上述方法tRNA分子的测序产量较低,并且没有报告是否使用该方法再现了现存的体内tRNA丰度和/或tRNA修饰。

研究团队发现,对原始纳米孔信号强度再处理,用RNA接头填充5′和3′tRNA末端,可以准确地进行碱基判定和映射,并捕获整个tRNA序列,使tRNA reads的数量增加12倍,并获得准确的tRNA丰度。这种基于纳米孔的方法被命名为Nano-tRNAseq(图1),可用于对天然tRNA进行测序,并在单个实验中获取到tRNA丰度和修饰动力学的定量估计。

研究团队表示,在体外和天然tRNA分子测序、碱基判定和映射方面,Nano-tRNAseq方法是使用纳米孔进行DRS最成功的方法。

图1.Nano-tRNAseq可以有效地对天然tRNA进行测序。

天然tRNA具有短而高度修饰的特性,这使它们的比对具有挑战性。对DRS数据集中修改碱基的不准确判定也使原tRNA检测含有很大比例的不匹配碱基。由于这些错误的碱基,使用推荐设置的常用长读长映射工具minimup2(-ax-map ont-k15)仅可以比对一小部分reads(2.56%)。

为了提高Nano-tRNAseq reads可映射性,研究团队测试了短reads映射算法BWA,发现使用推荐参数BWA-MEM比对在映射readas的比例方面优于minimup2。当使用参数为-W13 -k6 -xont2d -T20的BWA-MEM时,发现增加的映射reads和错误比对之间存在最佳平衡,映射了54.63%的reads,错误比对很少0.19%。当在天然tRNA分子中比较两个映射算法的性能时,对比更加明显

随后,研究人员评估了Nano-tRNAseq reads的可映射性是否受5'和3' RNA接头长度的影响。研究发现,即使参考序列中没有RNA接头,短的和未修饰的序列也可以有效地比对,而短的和修饰的reads则从带有接头的延伸序列中受益匪浅,表明带有RNA接头的延伸序列分子对于指导富含“错配”短reads的正确比对至关重要,例如来自天然tRNA的短reads。(图2)

图2。映射软件和参数的选择显著影响映射tRNA reads数量。

MinKNOW软件用于分析每个孔处检测的连续电流信号,将对应于reads的信号转化为FASTQ文件(图3a)。研究人员通过调整其配置,与默认MinKNOW配置相比,捕获了约12倍的碱基调用(basecalled)和约4.5倍的唯一映射tRNA reads(图3b、c)。此外,使用自定义配置可以更好地概括tRNA  reads的相对比例(图3f),报告的tRNA丰度与预期值相关良好(图3g)。

图3.MinKNOW参数的调整增加了测序和映射tRNA  reads的数量。

DRS的情况下,天然RNA分子可以被测序,而cDNA链则不可以。接下来,研究人员分析了tRNAs的线性化是否会进一步提高测序产量。使用Nano-tRNAseq对酿酒酵母的总tRNA进行测序,分为有和没有逆转录步骤,发现在MinKNOW默认配置中,无逆转录步骤的reads数量更多。原因在于非线性化的tRNA比线性化的tRNA更结构化,导致解旋酶处理这些分子的速度更慢,可能增加了其被MinKNOW分类为reads的可能性。总之,tRNA分子的线性化提高了测序产量,因此逆转录步骤包括在所有随后的Nano-tRNAseq文库制备中。(图4)

通过进一步试验验证,研究人员证实Nano-tRNAseq可以量化tRNA丰度、tRNA修饰差异,识别tRNA修饰的相互依赖性。

图4:Nano-tRNAseq可以量化tRNA丰度和RNA修饰,以及捕获修饰的相互依赖性。

综上所述,Nano-tRNAseq方法能够使用纳米孔DRS准确且直接地以单转录物分辨率量化tRNA丰度和修饰谱,是一种简单、稳健、有效的tRNA测序方法。在文库制备方案中,成熟tRNA的5’和3’末端用RNA接头延伸,提高了tRNA分子的碱基调用和可映射性。研究人员通过自定义的MinKNOW配置更有效地捕获tRNA reads,且与tRNA长度无关,消除了长度依赖性偏差。该方法将有助于揭示tRNA生物学的动力学,并可能在不久的将来用于人类疾病的诊断和预测。

该文章通讯作者、基因组调控中心研究员Eva Maria Novoa博士表示:“tRNA分子可以被切割成小而稳定的RNA片段并在血浆中循环。这些分子在癌症患者中通常会发生改变,并且携带丰富的诊断和预后信息。Nano-tRNAseq是一种概念验证技术,可以以非侵入性方式量化这些分子,为开发一种简单、经济高效、高精密的方法铺平了道路。我们的目标是进一步开发这项技术,并将其与人工智能工具相结合,在不到3小时的时间内确定生物样本的恶性程度,且每个样本的成本不超过50欧元。”

参考资料:

Lucas MC, Pryszcz LP, Medina R, et al. Quantitative analysis of tRNA abundance and modifications by nanopore RNA sequencing [published online ahead of print, 2023 Apr 6]. Nat Biotechnol. 2023;10.1038/s41587-023-01743-6. doi:10.1038/s41587-023-01743-6

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01743-6、

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