再生医美：微球是如何激活胶原蛋白的新生的？

Hey guys，自从2021年开始，咱们就正式开始接触再生型医美填充剂了，很多人其实对再生的过程非常感兴趣，但是目前的临床试验验证的更多的是效果盒安全性，微观一些的实验则非常少。

我一直都觉得我自己的观点是，再生型填充剂的微球，需要跟皮肤组织充分接触才能起作用，这个观点一直都深深地印在我脑袋里，但是有时候跟一些求美者或甚至是医生都讲不清楚这件事情。就拿RB天使来说好了，我个人认为里面的微球也是随着HA的代谢而暴露在组织中，从而起作用的，并不是打进去的“瞬间”就开始生长了。无奈很多医生或者求美者都不这么认为，我就有种百口莫辩的感受，你跟网上有些人是真的说不清楚的。

那么今天的研究非常细致地论证了，微球是如何使得胶原蛋白新生的，我们不妨一起来学习一下。

胶原蛋白，特别是I型胶原蛋白（COLI），为皮肤提供结构支撑和拉伸强度。临床研究表明，注射可生物降解的羟基磷灰石钙（CaHA；Radiesse，Merz North America）在填充剂中是独特的，因为它能立即恢复容量，随后刺激胶原蛋白和弹性蛋白的产生，从而改善皮肤质量。先前的研究已经证明，在注射后一周，成纤维细胞包围CaHA微球。这些微球具有生物刺激作用，可导致成纤维细胞产生胶原蛋白。

CaHA在两步过程中刺激Ⅲ型胶原蛋白（下文简称COLIII）和Ⅰ型胶原蛋白（下文简称COLI）的产生，其中COLI逐渐取代COLIII，这与生理条件下的重塑和胶原产生过程一致。在临床实践中，CaHA通常用生理盐水和/或利多卡因以1:1或1:2（超稀释）稀释。先前使用各种CaHA稀释液（1:1.16、1:0.3、1:0.6、1:1、1:2和1:6.5）的研究发现，在90 天，COLI对COLIII的最大替代率发生在1:0.6和1:1的稀释液中。然而，CaHA浓度、稀释和扩散在成纤维细胞的最佳刺激中所起的作用尚未阐明。为了研究稀释和扩散对微球分布和随后成纤维细胞活化的影响，作者在两种稀释液下进行了离体实验，以评估CaHA微球渗透到组织中的程度。此外，作者在细胞培养中使用纯CaHA微球进行了体外实验，以确定浓度如何影响新胶原的诱导。

材料和方法

离体研究

准备5名年龄在35-55岁之间的女性患者，同意在腹部整形术后捐献腹部皮肤用于下文所述的研究。手术后立即将每位患者的新鲜皮肤样本分为两段（10 cm×10cm）。术中皮肤未暴露于任何麻醉剂或药物。

注射本研究离体部分使用的Radiesse。CaHA的两种稀释液制备如下：（1）用生理盐水1:1稀释，2%利多卡因，用0.01ml蓝色薄纱墨水着色；和（2）用生理盐水1:2稀释，2%利多卡因，用0.01毫升粉红色的薄纱墨水着色。一个皮肤片段以1:1稀释的扇形技术皮下注射，另一个片段以1:2稀释的类似方式注射。注射是用25G38mm的星形钝针进行的，该钝针从组织节段的中心开始，并继续进行10线逆行注射以覆盖整个区域。

图1

扩散：

注射区域在注射后按摩1分钟，然后在中间用尺寸为22的手术刀切割，以评估CaHA扩散的深度和范围。使用毫米卡尺测量排列。横向扩展测量包括水平线的最宽（最大横向扩展）和最窄（最小横向扩展）范围。使用油墨垂直线的最小和最大渗透程度来评估涂布的深度。

颗粒分布：

从每个皮肤样本中取出4毫米穿孔活组织检查，并用H&E染色。病理学家对样本进行分析，并统计活检样本中CaHA颗粒的平均数量。

体外实验

细胞培养：在含有血清的成纤维细胞生长培养基2（PromoCell，Heidelberg，Germany）中培养原代正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）。对于所有实验，将NHDF孵育长达72小时。随着CaHA微球数量的增加：1.5mg/ml（CaHA微球的高稀释度）、3.0mg/ml和4.5mg/ml（CaHA微球的低稀释度）。在实验开始时总共接种了5000个NHDF。24小时后，NHDF的总数约为7500–10000，和72 h超过15000。

在24和72小时后评估NHDF中的读出COLIII蛋白表达和COLI合成孵育。

使用统计分析SigmaPlot版本14.0进行统计分析。使用Holm–Sidak方法进行单因素方差分析（ANOVA），将体外COLI和COLIII表达水平与对照进行比较。双尾Studentt检验用于分析与对照相比，在与增加量的CaHA孵育后COLIII高细胞的增加。

结果

离体研究

CaHA稀释度越高，扩散宽度和深度越大。

表1

稀释度越高，颗粒分布越大。

注射1:1CaHA的皮肤节段活检样本平均有70个颗粒，而注射1:2CaHA的活检样本平均为32个颗粒（图2和图3）。这些结果表明，更高的稀释度产生了更大的CaHA颗粒分散度，并相应地降低了每组织面积的颗粒浓度。

图2

图3

体外研究

CaHA微球的生物刺激显示24小时后新胶原生成增加与对照组相比，在用4.5mg/mlCaHA孵育后，NHDFs中COLIII的表达平均增加到123%（p<0.001）（图4）。该表达水平在72h后保持恒定（p<0.001)。

图4

COLIII表达的增加需要与CaHA微球直接接触。进行单细胞分析以进一步解决CaHA的生物刺激特性。该分析表明，只有与CaHA微球直接接触的NHDF细胞具有增加的COLIII表达（图5）。

不与CaHA微球直接接触的NHDF与未刺激的NHDF具有相同的COLIII表达水平（图5A）。COLIII高细胞中COLIII的平均增加是未刺激细胞中平均表达水平的1.7倍。微球的包封是清晰可见的（图5B），并且仅在与CaHA微球直接接触的NHDF中存在（图5C）。COLIII高细胞早在24h，并72小时保持稳定（图5D）。

图5

诱导COLIII高表达细胞与CaHA微球的量成比例。为了确定是否存在诱导COLIII低表达细胞增加活化所需的CaHA微球阈值量，在1.5至4.5mg/ml的不同量的CaHA稀释液的存在下孵育相同数量的成纤维细胞。作者观察到与CaHA浓度相关的COLIII高表达细胞的比例增加：1.5mg/ml产生9.7%的高表达细胞（p=0.010），3.0mg/ml产生14.2%的增加（p=0.06），4.5mg/ml产生23.7%的增加（p=0.03）（图6A）。COLIII高表达细胞被CaHA微球完全激活，并导致每个细胞的COLIII表达水平相同，与CaHA的量无关（与对照相比为185%；p<0.001）（图6B）。

图6

讨论

离体研究结果证实，与稀释度较低的溶液相比，稀释度较高的CaHA会导致CaHA微球的更大传播。这通过两种稀释液的染色区域的测量（宽度和深度）来验证。正如预期的那样，由于CaHA颗粒在组织中的扩散增加，CaHA制剂的稀释在注射皮肤的每个区域产生更少的CaHA颗粒。在1:2稀释的活检区域中检测到的颗粒数量约为1:1稀释中检测到数量的一半，这证明了这一点。

体外结果表明，CaHA与成纤维细胞的接触是诱导新胶原生成的关键因素。此外，体外数据显示，随着CaHA浓度的增加，COLIII的产量增加。然而，可以看出，这种增加并不是由于细胞水平上COLIII产生的增加，而是因为注射的CaHA微球能够激活更多的成纤维细胞。

CaHA微球和成纤维细胞之间的直接接触如何刺激新胶原生成的机制尚不完全清楚。微球可以通过拉伸成纤维细胞来诱导活化，但机械感受器也可能发挥作用。在这种体外环境中，作者观察到微球的包封导致COLIII水平的增加。COLI合成在72时增加，其中COLIII合成保持恒定。

总之，成纤维细胞和CaHA微球之间的直接接触对于胶原的形成是必要的。靶向稀释可以改善这种体内接触。这些发现很重要，因为它们可能会启动在特定身体区域注射CaHA的标准化稀释方案的开发。它还可以帮助临床医生改进标准稀释度和标准注射深度的临床随访研究设计，以获得最佳临床结果。这种可定制的方法应允许每位患者接受最佳治疗，这有望提高患者满意度并减少潜在并发症。

参考文献

1. Nowag B, Casabona G, Kippenberger S, Zöller N, Hengl T. Calcium hydroxylapatite microspheres activate fibroblasts through direct contact to stimulate neocollagenesis. J Cosmet Dermatol. 2023 Feb;22(2):426-432. doi: 10.1111/jocd.15521. Epub 2022 Dec 27. PMID: 36575882.