特别关注｜脂多糖在肝癌发生发展中的作用

肝癌是一种由多种因素导致的肝细胞或肝内胆管上皮细胞癌变所形成的恶性肿瘤，是我国及世界范围内重大的公共卫生疾病。2020年全球统计数据^[1]显示，肝癌新发病例数在全球常见恶性肿瘤中排名第六位，是全球第三大癌症死亡病因。肠道微生物群是与人体共生的微生态系统，由细菌、真菌、古细菌及病毒组成，携带的遗传信息约为人类基因组的100倍以上，承担协助消化、胆汁酸循环、调节免疫等多重生理功能，又称为“被遗忘的器官”。近年来，多项研究证实肠道微生物特别是肠道细菌参与肝癌的形成、进展、转归及治疗过程并起重要生物学作用^[2-3]。革兰阴性细菌独特的外膜结构——脂多糖(LPS) 大多由核心糖、Kdo2-类脂A(Kdo2-Lipid A)、O-抗原三部分构成，其中Lipid A是主要成分^[4]。LPS作为重要的毒力因子与保护性抗原，在多种病理状态下可伴随细菌突破肠黏膜屏障入血进入门静脉系统，通过“肝-肠轴”代谢途径参与肝细胞的固有免疫及适应性免疫反应，并在多种病理微环境下通过免疫炎症损伤机制促进肝硬化进展及肝细胞癌的形成，是本领域的研究热点。

深入研究肠道细菌LPS参与肝癌发生及进展的生物学过程，有助于进一步揭示肠道细菌潜在的致癌机制，筛选新一代可用于肝癌临床二级预防的生物学靶点。本文针对LPS在原发性肝癌发生、进展与转归过程中的生物学功能及致病机制做了进一步分析，为下一步针对LPS靶点的肝癌防治研究提供借鉴。

1肠道微生物的多态性变化及肠道屏障功能的减弱是LPS致癌的病理微环境

1.1   肠道微生物多态性改变促进肝癌的发生

近年来，肠道细菌参与包括肝癌在内的多种消化道肿瘤致病过程，已被广泛认可^[5-6]，一方面因为高通量测序及宏基因组学技术的广泛推广，进一步实现了从基因水平上探究肝癌肠道菌群多态性。例如，应用16s rDNA测序技术对比分析不同阶段肝癌、肝硬化及健康人肠道菌群，发现肝癌组中拟杆菌门的丰度值较对照组明显降低，而路氏球菌却显著升高达100倍，这提示包括肠球菌、变形杆菌在内的多种细菌具备作为肝癌无创诊断学标志物的潜力^[7]。同时提示伴随肝功能恶化进展，韦荣球菌属同甲胎蛋白呈现正相关而与罕见小杆菌负相关，这表明不同阶段菌群的失调性变化很可能是促使肝硬化向肝癌转化的重要因素之一^[8]。另一方面，受肠道微生物体外培养技术限制，目前可分离培养的肠道微生物占比尚不足30%，因此临床应用研究进展主要集中在肠道菌群重建方面。在动物模型中，粪便微生物群移植(FMT)可重建酒精性肝病患者肠道拟杆菌属缺失，治疗脂肪性肝炎、艰难梭菌感染等^[9-10]。在临床研究中，重建肠道菌群可影响PD-1抑制剂对肝癌患者的疗效^[11]，而且可降低致癌相关炎性因子IL-6及LPS结合蛋白的表达^[12]。研究^[13-14]表明，目前广泛应用于临床的益生菌不仅有助于调节肠道菌群多态性，嗜乳酸杆菌(L.acidophilus ATCC 4356)表面多糖还可通过抑制多糖相关固有免疫反应TLR2/STAT-3/P38-MAPK途径从而降低早期致癌风险，是潜在的肝癌二级预防用药^[13-14]。

1.2   LPS是肝脏炎症损伤及再生修复过程中重要的诱导因子

生理情况下，肠道微生物群与机体处于稳态平衡，极少量LPS可突破肠黏膜屏障入血或淋巴管并与高密度脂蛋白HDL3及乳糜微粒相结合从而最终被肝脏清除，同时该过程并不显著引起肝脏固有细胞及Kupffer细胞的免疫炎症反应^[15]。一方面，上述LPS的体循环过程可造成持久温和的全身炎性反应，研究表明LPS可促进肝脏前体蛋白转化酶PCSK9的合成来干预肝脏脂质代谢，上调的PCSK9水平可与肝细胞表面低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的受体相结合来抑制LDL-C的消耗，从而促进动脉粥样硬化及脂肪肝的形成。同时高脂血症及脂肪肝的发生可进一步增加肠黏膜通透性，通过肝肠循环途径增加肠源性内毒素血症的风险^[16-17]。另一方面，研究发现，一定程度的LPS暴露可对包括肝纤维化、肝癌在内的肝损伤发挥正向的再生修复作用，LPS可通过诱导维持肝细胞的干性表型、促进分泌肝细胞营养因子及相关细胞因子等途径减轻肝损伤促进肝细胞增殖修复^[18]。然而，目前可定量干预肠道微生物LPS的技术手段仅局限于口服益生菌制剂、抗生素等方法，针对肝癌组织微生物LPS的多态性尚缺乏研究，而目前基于瘤内微生物宏蛋白质组学的研究大多集中分类于细菌门/属，发现变形杆菌及厚壁菌作为癌组织微生物的优势菌群占比70%以上，同时门分类中革兰阴性菌的弯曲菌、单胞菌显著上调^[19-20]。此类肿瘤组织中极少数代表性细菌的LPS多态性分布及免疫学机制值得深入研究。

1.3   肠道屏障功能的减弱是LPS内毒素血症及下游促癌炎症反应的重要条件

众所周知，肠道屏障由包括肠碱性磷酸酶(IAP)、黏液层、肠上皮细胞及固有免疫层在内的四部分构成^[21]。生理状态下，肝脏通过门静脉系统接受源于胃肠道75%的血供，同时在肠道屏障多重结构的保护下，极少的肠道细菌及其病原相关模式分子(PAMP)通过体循环入肝脏。然而在肝癌及肝硬化等状态下，IAP对肠道细菌LPS类脂A结构的去磷酸化作用减弱^[22]，同时由于上皮细胞间紧密连接结构的进一步破坏，未经IAP去磷酸化作用减毒的LPS及其他PAMP可顺势突破肠道屏障进入体循环毛细血管中与LPS结合蛋白及其他脂蛋白相结合，进而形成门静脉LPS内毒素血症^[21-23]。

根据Marshall在1998年提出的“肝-肠轴”理论，肝脏作为首个经门静脉接触肠源细菌内毒素及其他PAMP的消化腺，其Kupffer细胞、肝细胞及星状细胞可被动员并激活下游一系列固有及适应性免疫炎症反应从而损伤肝脏，同时肝脏炎性损伤可反向下调肠道的生理功能。近年来多项动物模型研究表明，上述慢性肝脏炎症损伤-修复机制显著促进了肝癌的发生，参与肝癌的进展过程^[24]。然而，由于肠道革兰阴性细菌体外培养技术限制、LPS致癌机制复杂等原因，目前基于临床的菌群致癌机制研究有限，需要进一步深入探究。

2LPS相关免疫反应是肠道菌群致癌的核心机制

2.1   肠道细菌通过LPS-Toll样受体(TLR)途径引发下游炎症反应，参与肝癌的发生与进展

在肝硬化、肝癌等病理情况下，多态性改变的肠道微生物群与减弱的肠屏障相互作用，使大量未经IAP充分脱磷酸失活的LPS经门静脉入肝，并在CD14的辅助下通过Lipid A结构与Kupffer细胞表面的TLR家族成员TLR4结合，通过髓样分化初级反应蛋白(MyD-88)依赖及非依赖途径激活下游NF-κB、STAT-3通路，从而刺激细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等的产生，进而通过慢性炎症损伤-修复机制促进肝癌的发生^[24-25]。在动物模型中，经化学法诱发的肝癌小鼠经抗生素无菌化处理后，可明显降低肝癌发生率及局部肿块大小，并通过LPS-TLR4途径下调多个细胞因子的表达，反向验证LPS抑制细胞凋亡的同时降低细胞对活性氧(ROS)的敏感性，也说明了肠道细菌确实参与肝癌的发生过程^[26]。不仅如此，研究^[27]表明LPS-TLR4途径深度参与晚期肝癌的转归过程，而在肝癌早期LPS主要通过MyD-88非依赖旁分泌方式，上调肝星状细胞分泌表皮调节素从而促进肝癌的进展，说明肠道细菌LPS-TLR4途径很可能是临床晚期肝癌治疗药物的全新干预靶点。但遗憾的是，目前临床针对肠道细菌LPS-TLR4途径仍以间接性单用或联合抗生素如利福昔明、多黏菌素B等干预治疗为主，尚缺乏可用于人体的直接针对性靶向阻断剂^[28-30]。

2.2   细胞因子介导免疫信号通路是LPS介导肝癌进展和转移的核心分子途径

LPS-TLR4激活下游NF-κB通路产生的多种细胞因子具有不同的信号功能，依据经典的“多重打击”理论，细胞因子IL-1β介导的效应细胞对肝细胞的免疫损伤及TNF-α与对肝细胞的直接杀伤作用，均被认为是固有免疫对肝细胞的第一重打击^[31]。然而肝细胞癌的发生及进展过程除上述免疫损伤外，还伴随着长久的慢性再生-修复过程，例如IL-6可激活下游JAK/STAT-3途径，通过失活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)、下调ROS来抑制Fas介导的细胞凋亡，从而发挥对肝细胞的再生修复作用^[32-33]。不仅如此，在晚期肝癌的小鼠模型中，LPS-TLR4途径被证实可上调表皮生长因子(EGF)家族成员肝脏丝裂原的产生，从而动员EGFR、HER2受体参与晚期肝癌的进展过程^[27]。另外，随着肝癌进展至不同阶段，肿瘤微环境的变化伴随不同的免疫反应，LPS-TLR4途径的激活可动员巨噬细胞分泌IL-10及趋化因子CCL22，CCL22可正向募集调节性T淋巴细胞(FOXP3⁺Treg)向肿瘤细胞聚集，同时IL-10负向调节肿瘤细胞对TNF-α、IL-2等的敏感性，而上述变化的微环境加速了肿瘤细胞的免疫逃逸，进而形成肝内转移^[34-35]。

3针对“LPS-TLR4”途径的干预是肝癌“靶向治疗”的全新发展方向之一

因肠道菌群基因组庞大及分子水平研究技术限制，传统针对肝癌肠道细菌LPS的抗肿瘤治疗方案大多是以抗生素、FMT及益生菌为代表，通过平衡菌群多态性、修复肠屏障功能来改善门静脉内毒素血症，从而间接下调包含TLR4在内LPS配体介导的下游炎症反应。近年来随着高通量测序、基因编辑及分子靶向技术的进展，研究者^[36]发现CRISPR技术已在治疗酒精性肝损伤获益方面被证实远大于传统FMT，具备极大潜力用于治疗肝癌免疫性损伤。随着LPS的合成通路逐渐被研究者揭开，发现LpxC是Lipd A合成通路中第一个关键酶，合成可强效抑制LpxC酶的新型化合物分子LPC-011等从而实现化学法敲除LPS，为下一步在动物模型上研究LPS在肝癌进展、转归过程中的免疫学作用及LPS在局部肿瘤内外微环境中的生物学作用提供了全新的技术工具^[37]。另一方面，研究者针对LPS受体TLR4设计了小分子化合物TAK-242，能够在不影响LPS与巨噬细胞结合的情况下抑制下游多种细胞因子及一氧化氮(NO)的产生，是潜在可用于治疗进展型肝癌的候选靶向药物，同时为进一步研究细胞因子炎症反应在癌症不同阶段的损伤-修复机制提供新思路^[38-39]。除上述人工合成小分子外，据报道一类天然海洋真菌提取吲哚生物碱——新棘菊素A(Neoechinulin A)可剂量依赖性抑制IκB-α的磷酸化降解从而抑制LPS-TLR4途径下游NF-κB及p38 MAPK通路，下调致癌相关性炎症反应^[40-41]。目前，新棘菊素A已被证实可有效抑制神经性炎症反应，但在包括肝癌在内的恶性肿瘤中的抑癌机制仍缺乏进一步研究，很可能是一种针对LPS-TLR4/NF-κB通路的潜在新型靶向抗肿瘤药物^[40]。随着细菌LPS致癌机制的揭示，未来基于肠道细菌LPS-TLR4通路的“靶向”药物具有极大的发展潜力，随着脂蛋白结合药物转运系统的成熟，未来基于LPS-TLR4靶点的药物递送系统可更加精准的发挥抗肿瘤作用，是临床“靶向”精准治疗的热门发展方向^[42]。

4结语及展望

近年来随着肝癌致病机制不断被揭示，明确了肠道微生物在肝癌致病过程中具有重要的生物学地位，很可能是除病毒性肝炎、酒精/非酒精性脂肪肝、糖尿病及其他代谢综合征之外的另一大关键性危险因素^[43]；发现了肠道微生物多态性分析可作为肝癌早期筛查的无创性生物标志物^[6]；证明了肠道细菌LPS相关性炎症反应参与肝癌的发生、进展及转归过程(图1)。目前肝癌非手术治疗手段有限，以免疫检查点抑制剂、酪氨酸激酶受体拮抗剂及表皮生长因子受体拮抗剂为代表的系统性治疗药物面临基因突变耐药、对应肿瘤分期严格等限制条件下，因此研制新型作用于LPS-TLR4靶点的抗肿瘤药物尤为重要。

图1  肠道微生物LPS致癌机制

需要指出的是，虽然TLR4是细菌LPS激动的主要受体，但仍不排除其他Toll受体家族成员被LPS激动引发旁路致癌途径，并且不同细菌属的LPS结构不尽相同^[24]，特定代表性细菌如大肠埃希菌(E. coli) 应致癌的具体机制尚不明确，仍需进一步研究。另一等的O抗原、Lipid A结构激动肝固有及适应性免疫反方面，除革兰阴性菌外，肠道革兰阳性菌的胞壁酸结构是TLR2的配体^[13]，可与胆汁酸的初-次级代谢过程协同造成肝细胞DNA的损伤，形成肝星状细胞衰老相关分泌表型，而促进肝癌的进展和转移^[13-44]。

综上所述，现有肠道细菌LPS与肝癌致病机制研究主要集中在动物模型，对临床应用研究有限。下一步，以下几方面将是今后临床研究的重要方向：(1)提取特定代表性细菌外膜结构组分并体内验证其交叉致癌效应；(2)研制LPS作为潜在免疫佐剂的药物靶向递送系统；(3)针对性合成或提取高效的靶点抑制剂。

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http://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.3969/j.issn.1001-5256.2023.07.032

引证本文

王涛, 王权, 宋立华, 等. 脂多糖在肝癌发生发展中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2023, 39(7): 1734-1739