纳米孔测序仪MinION的首批测序数据公布

美国佛罗里达州的马可岛是基因组测序行业的“麦加”，一年一度的基因组生物学技术进展大会（AGBT 2014）一直在这召开，已超过10年历史。本次峰会的主题是“新仪器带来的潜力技术革新”。Oxford Nanopore自去年11月启动MinION测序仪的早期试用计划以来，人们一直就在翘首盼望着MinION的测序数据，日前有关MinION的首个数据终于在本次峰会上出炉。

MinION 测序结果成最受关注之一

2年前，英国Oxford Nanopore公司也是在AGBT上宣布了MinION测序仪的消息，并告知科学家们：MinION是利用纳米孔技术制成的测序系统，具有体积小巧、即插即用的特点，其可能带来巨大的利润迅速引起市场轰动。同时该技术使得成千上万个的超长碱基构成的DNA链在一个单通道中就能够被解码和识别，而不需要将长链分割成小短链一一破译。

尽管Oxford Nanopore没有派任何人到佛罗里达参加会议，但有一名与其合作的剑桥大学Broad研究院的计算生物学家David Jaffe 在此次大会上介绍了两个微生物测序样品的数据，其中一个来自普通 Escherichia coli （大肠杆菌），另一个来自革兰氏阳性菌Scardovia wiggsiae（一种存在于蛀牙中的细菌），分别含有460万和155万对碱基。

据介绍，测序实验是由Oxford Nanopore开展的，文库制备的基本步骤是从高分子量DNA开始的，片段化DNA，无需大小选择，再连接接头。双链DNA的一端被系住，让测序过程更加容易。纳米孔中的酶使其变成单链DNA，再通过纳米孔。随着单链DNA 通过纳米孔，测序系统根据电流变化确定DNA序列。

MinION测序原理示意图

多个研究瓶颈亟待解决

NO 1:寻找新型膜材料成MinION测序关键控制点

采用纳米孔技术进行DNA测序这个想法的提出差不多有20多年，然而该技术才在2012年被Oxford Nanopore实现。Oxford Nanopore表示：由于原来的膜材料不能大规模生产，公司在过去的2年一直在寻找一个新的纳米膜来透过DNA分子。

NO 2：多碱基函数模型的建立

研究人员表示：在测序的过程中，纳米孔内的电流并非单个碱基的函数，而是纳米孔中数多个碱基的函数，这让整个测序过程及碱基的推断变得很困难，因此希望以单碱基分辨率获得信号。

NO 3：测序结果系统性的缺失难克服

David Jaffe还介绍目前MinION测定的是6聚体的信号。它的原始数据是电流（或电压）相对于时间的图像。David Jaffe将数据称之为波形曲线（Squiggles）。Oxford nanopore科学家面临的计算挑战是将k-mer的波形曲线转化为序列数据。

据介绍，MinION上的平均读长达5.4 kb，有些长达10 kb。这比目前主流测序技术的读长要长，但仍未达到Oxford nanopore之前宣布的100 kb。在David Jaffe展示的数据中，有一段reads没有错误，而另一块区域有不少错误。它也存在系统性的缺失，如6个reads中的5个少了一个T。David Jaffe称，84%的reads至少有一个完美的50聚体，而100%的reads至少有一个完美的25聚体。

“矮矬穷”能否逆袭“高大上”？

美国国家人类基因组研究所技术发展主任 Jeffery Schloss说：“尽管纳米孔技术还处于早期阶段，但其为测序分析带来的影响是深远的。”

虽然Oxford Nanopore旨在为个体研究者提供了便宜的手持式测定设备，但是对于MinION首次公布的数据，业界反应不一。

Illumina公司作为传统的“高大上”测序行业的领头羊，一直致力于为测序机构定制高端的设备，但在上个月却推出价廉的测序仪器，例如在上个月首推1000美元的测序服务，并有媒体认为其将广泛被用于医疗行业的常规测序部分。Illumina公司的机器,就像其他所谓的下一代测序,确定DNA的碱基,然后再进行链匹配的DNA测序。通过化学法来标记碱基，然后将序列划分为若干小的片段，最后再将每个部分测定的许留进行拼接。

与Illumina公司截然不同的是，Oxford Nanopore采用的方法是:MinION先将一个长链的DNA链进行拉伸，然后使其通过一个微小的孔。每一个碱基通过纳米膜时会产生的干扰离子电流不同， 从而可以有效地鉴别碱基。

高盛的分析师Isaac Ro在一份研究报告中称，Oxford Nanopore似乎仍在开发阶段，此时不大可能威胁Illumina的竞争地位。 Illumina公司在加州的高级营销经理Joel Fellis说，到2017年，美国需要组建100,000 名参与者的基因组图库。

怀特黑德生物医学研究所的遗传学家Yaniv Erlich表示：这个消息如同几年前Illumina公司推出 36-base-pair读取技术时一样令人兴奋。小型、廉价而且便携的MinION虽说不像其他大型仪器一样，但如果Oxford Nanopore继续提高技术，MinION将有潜力撼动测序市场，并实现当今无法实现的多个应用。

加州大学(UC)的纳米膜专家David Deamer说，MinION在实际运用中具有非常可观的前景：一方面，在食品安全中对前体食品中的微生物进行实时分析的安全测试；另一方面，MinION可以识别古代DNA，这将可能为考古界带来新的发现。

充满“陷阱”的MinION营销

早前，Oxford nanopore宣布了MinION的试用计划。参与者在支付1,000美元的押金和运费后，将收到一台MinION测序仪，包括测序USB装置、流动槽和软件。

2月14日，一些幸运的申请者已经收到了此计划的邮件，他们称之为甜蜜的情人节礼物。第一轮中，参与者将采用 “Oxford nanopore提供的DNA来学习如何使用 “MinION”，熟练之后，他们可以尝试任何他们喜欢的DNA。

然而，这里有一个陷阱，任何买家都必须至少10机器并同意使用他们只对人类基因组测序。

加州大学圣克鲁斯分院生物工程师Zak Wescoe说，这个价格对于一般研究人员来说比较昂贵。

华盛顿大学基因组研究所主任Elaine Mardis说：“1000美元的测序仪器一般都可以满足试验要求。很多地方对测序要求没有高达18000的碱基序列分析的能力”。

Deanna Church是加利福尼亚州Menlo Park的基因测序专家，他希望无论是高端仪器，还是低端的手持式设备，都能够拥有一个合理的价格，这样讲有更多的玩家可以消费得起，将新研发的仪器借给研究者使用将有助于开发出一些新的应用程序，也会有助于原来仪器技术的改进。