詹姆斯·威尔：肿瘤中的细胞凋亡

詹姆斯·威尔   美国国家科学院院士，美国加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF） 主席，UCSF药理系主任。

　　细胞凋亡（Apoptosis）是细胞内能量依赖的死亡程序活化而致的细胞自杀，是由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程。正常情况下，细胞凋亡对机体是一种保护作用，是为了更好地适应生存环境而主动采取的一种死亡过程。

　　在细胞凋亡领域，笔者对两个方面最感兴趣：①细胞的凋亡是级联反应过程，其中究竟有多少蛋白质参与？②了解细胞凋亡的同时，如何利用该过程寻找肿瘤治疗或监测的新靶点？

　　细胞凋亡的发生

　　在整个细胞凋亡过程中，caspase家族即半胱天冬蛋白酶起着必不可少的作用，我们称之为凋亡蛋白酶，细胞凋亡的过程实际上是caspase不可逆地有限水解底物的级联放大反应过程。

　　Caspase家族主要分为两类，一类为凋亡启动因子（caspase2、8、9、10），一类为凋亡效应因子（caspase3、6、7），这两类因子引发细胞凋亡。Caspase 家族中还有一部分是炎症蛋白酶（caspase1、4、5），其活化后会激活一系列的细胞因子，从而使机体产生一系列的免疫反应，引发炎症。

　　由此可见，在细胞凋亡过程中，caspase活性的启动很关键，虽然caspase分子各异，但活化过程却相似：首先，在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后蛋白酶再在大小亚基之间切割释放大小亚基，进而形成有活性的四聚体。

　　不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号途径也不一样，细胞凋亡主要有两条通路：膜受体通路和线粒体通路。细胞接受外源性信号刺激后，通过激活细胞膜表面的死亡受体，经肿瘤坏死因子（TNF）或者FAS（一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员）系统启动caspase的级联活化，细胞发生凋亡；另外，某些DNA损伤或细胞内应急信号的出现，会通过胞浆中的促凋亡蛋白（Bax 和Bid等），将凋亡信号传递至线粒体，造成线粒体损伤并诱导其激发线粒体通透性转变（MPT），释放细胞色素C（Cyt C），从而引发细胞凋亡。

图A 细胞的凋亡

图B Caspase前体结构

　　细胞凋亡的过程

　　在这样一个复杂的凋亡系统中，这些事件的发生顺序是什么？细胞凋亡中每一个蛋白分解物又如何行使其功能？

　　从转化医学的角度来说，研究参与凋亡过程的每一个分解物有助于肿瘤的治疗。首先，针对现有已知的凋亡蛋白和信号分子，很多制药公司都在不同层面上进行了研究，这有助于我们发现新的肿瘤治疗靶点。其次，我们还可以找到某些凋亡蛋白或凋亡过程中产生的不同信号分子，用以监测肿瘤药物的疗效，这些凋亡信号分子的产生非常迅速，在肿瘤细胞凋亡过程中，这些标志物是否出现影响了对药物疗效的监测是否快捷而有效。

　　如何鉴定在凋亡过程中caspase剪切产生的每个蛋白质底物呢？ 我们研究组的Mahrus博士等建立了一种方法，该方法可特异性地标记蛋白质的N 端，从而富集N 端肽段以鉴定蛋白酶切的位点[Cell，2008，134：866]。在细胞凋亡后，Mahrus等采用枯草菌连接酶把自由的N 端连接上生物素肽, 然后用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）分析。

　　通过该方法，研究者发现了细胞凋亡过程中超过1千种的新蛋白。研究者还发现，蛋白酶并非针对多个位点一次性剪切，而是针对不同位点进行一次或两次剪切，酶切位点往往位于蛋白表面及环形结构上，并且很多蛋白底物之间存在相互作用。

　　因此，我们可将整个细胞凋亡的过程比喻成一座大桥的坍塌，开始只是某个部位出现裂缝（酶的一次剪切），接着其他部位也出现裂缝（酶的二次剪切），最终导致整个大桥的坍塌（细胞凋亡）。

　　细胞凋亡与肿瘤的治疗

　　面对机体内如此复杂的凋亡过程，我想和大家讨论3个问题：①我们已知的细胞凋亡信号通路在临床工作中有何意义？②我们能否了解这些凋亡事件的时间顺序？③我们能否一次性阻断凋亡过程中的一个靶点，从而影响整个细胞的凋亡？

　　Caspase 可通过破坏多种抗凋亡的因素发挥作用。在机体内，当染色体处于转录状态时，一方面，caspase 3或7 可激活名为 CAD（Caspase-Activated Dnase）的核酸内切酶，其能在核小体的连接区将核小体切断，形成约为200 bp 整数倍的核酸片段。

　　正常情况下，CAD存在于胞质中，并与抑制因子ICAD/DFF-45 蛋白结合，不能进入细胞核。Caspase 活化后可降解ICAD/DFF- 45，释放CAD，使其进入细胞核降解DNA；另一方面，核受体共抑制因子（N-CoR/SMRT）及其相关蛋白组成的复合物可使转录状态的DNA 处在粘合状态（Compacted），抵抗核酸内切酶的作用，避免凋亡的发生，而caspase可对该复合物中蛋白的不同位点进行剪切，消除N- CoR/SMRT复合物的抗凋亡作用。

　　由此可见，caspase不仅会激活核酸内切酶，而且会抑制整个凋亡系统中不同功能的酶。目前，已有一些制药工作针对这两方面研发了一些药物。

　　我们能否在大规模地计算这些细胞内酶的催化速率呢？我们研究组的Mahrus和Agard博士等正在开展这方面的工作，研究者将caspase 加入 Jurkat 细胞（人外周血白血病T细胞）裂解液中进行反应，用上述N-端标记的方法在不同的时间点对蛋白进行标记后，采用高通量单反应监测（Single-Reaction Monitoring，SRM）技术分离鉴定，这样便能计算出在每个时间点所裂解的蛋白质浓度。通过该技术不仅可以确定整个凋亡过程中出现的每种蛋白，而且可以了解每种蛋白的裂解情况及蛋白质量的变化。

　　我们以caspase 3 为例研究发现，caspase 3 对每种蛋白的裂解速率并不相同，有时可达到500倍以上的差距。这应该是一个非常新的研究领域，在未来，该方面的研究可能对整个肿瘤领域的发展有非常重要的作用。

　　前面提到，caspase 在凋亡过程中是针对多个靶点发挥作用，我们能否找到这样一个位点，对该位点作用可以影响细胞的整个凋亡过程，类似于堆积的积木，牵一发而动全身？这对寻找肿瘤治疗的靶点或疗效的监测有重要的作用。

　　我们在细胞内进行的研究发现[Cell，2010，142：637]，三种凋亡效应分子均是短暂地激活，但仅caspase 3或7的激活足以诱导细胞的凋亡，而对于caspase 6，无论剪切哪个位点都未出现细胞的凋亡，因此，caspase 6与凋亡的整个过程并不密切。而且caspase酶不仅在激活后引起细胞凋亡，同时还有自我降解的过程，这是机体的一种自我调节。

　　蛋白质组学分析表明，26S蛋白酶体的33 个亚基中有20 个是由caspases 剪切的，且蛋白酶体抑制剂和剂量依赖性caspase活性之间有协同作用。因此，我们提出了一种蛋白酶间负反馈调节模型，该模型对蛋白酶体抑制剂和凋亡药物在临床的联合应用有影响。如果某药物能激活或抑制 caspase 3，同时也会对整个蛋白酶体系统有所影响。例如，蛋白酶体抑制剂MG132在激活caspase的同时会抑制蛋白酶体系统，两者协同发挥作用。药物硼替佐米能够抑制蛋白酶体，诱导细胞凋亡，虽然具体机制尚不清楚，但我们可以推测其影响着caspase的活性。

DISC：死亡诱导信号复合物    Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子-1

细胞凋亡的两条主要通路 

　　细胞凋亡与疗效的预测

　　在临床实践中，我们如何利用这些蛋白寻找有效的生物标志物？若能精确地预测化疗疗效，我们就可以尽可能地延长有效药物的化疗时间，尽可能缩短无效药物的治疗时间，合理地应用药物。因此，寻找合适的生物标志物对药物疗效进行合理的评估是非常重要的。

　　每个个体对肿瘤治疗的反应并不相同，如果某药物对某种肿瘤细胞有效的话，该肿瘤细胞就会发生凋亡，释放很多凋亡产物，若能对凋亡过程中出现的这些蛋白进行测定，也许我们不必花时间等待患者影像学特征的出现再预测药物是否有效，这可能需要数月的时间，而在这之前，我们可以利用凋亡中释放的这些标志物来确定化疗疗效，可能在几小时或几天后就可以预测该药物是否有效。

　　CK18 是乳腺癌重要的凋亡标志物。有研究显示，如果乳腺癌药物治疗有效，肿瘤细胞会释放高浓度的CK18，通过对血清中CK18的检测可以发现，CK18水平较高者生存也较好。这只是其中的一个例子，我们能否发现更多类似的生物标志物呢？抑或在同一肿瘤中能否发现多种生物标志物？我们可以通过检测肿瘤细胞接受药物治疗后出现的稳定的凋亡产物来选择合适的标志物，这是我们目前的研究思路。

　　在临床前研究中，我们通过对淋巴瘤细胞（包括T细胞和B细胞）经肿瘤药物治疗（多柔比星）后凋亡蛋白的测定，发现了350 种特异性裂解物，有的只在 T 细胞表达，有的只在B细胞中表达，或者两者共同表达。通过该例子可得知，我们可以在不同的肿瘤细胞中寻找不同的凋亡标志物，另外，根据凋亡蛋白的差异还能观察到肿瘤对某化疗药物反应的不同。但对于整个组织来说，凋亡蛋白测定还存在一定挑战：凋亡蛋白浓度太低，有时难以检测；有些蛋白不稳定，很快就会降解；这些蛋白有可能是由正常组织产生。这些都会给整个研究带来困难，我们实验室正尝试着去解决这些问题，但尚未找到一个有效的解决办法。

　　我们实验室的研究者利用上述N-端标记的技术在人类血清和血浆中发现了多种蛋白，包括白蛋白、血管内皮生长因子（VEGF）等，并在浆细胞白血病的病例中发现，在CHOP（环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松）方案治疗前后，其中多种蛋白的浓度改变可达两倍（数据仍未发表），目前我们正在积累临床病例，以期找到多种标志物的联合，更好地预测肿瘤疗效。（彭群惠整理）