武汉大学张先正/程巳雪/程翰AFM：螺旋藻骨架纤维原位自聚集增强抗肿瘤热免疫治疗！

缺乏广谱肿瘤抗原、抗原的有限免疫原性以及肿瘤内的免疫抑制微环境阻碍了癌症疫苗的发展。为了解决这个问题，武汉大学张先正/程巳雪/程翰基于负载金(Au)纳米颗粒(Au@E-SP)的螺旋藻骨架纤维开发了一个疫苗平台。在皮下给药后，Au@E-SP原位自聚集并形成3D疫苗支架，这是由于其延长和螺旋结构。通过Au@E-SP的聚集，Au纳米颗粒被集中，显著增强了局部光热效应并释放出更多的肿瘤相关抗原。此外，保留的E-SP作为天然免疫佐剂，在体内持续逆转免疫抑制微环境。结合这些优势，疫苗诱导了强烈的抗肿瘤免疫反应，有效抑制了肿瘤复发和转移。这种策略利用微藻作为自我免疫佐剂疫苗，为肿瘤免疫疗法的进一步研究提供了有希望的途径。该研究以题为“In Situ Self-Aggregation of Spirulina Skeleton Fibers Enhances the Efficacy of Anti-Tumor Thermal Immunotherapy”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

该研究基于螺旋藻骨架纤维设计了一个创新的原位疫苗支架，以增强局部充血并激活抗肿瘤免疫反应(方案1)。首先使用乙醇(E-SP)灭活螺旋藻，不损害其螺旋结构或免疫活性，从而提高了其在体内应用的安全性。随后，螺旋藻纤维被用来吸附Au³⁺，并在原位合成具有光热效应的金纳米颗粒。在皮下注射后，佐剂在注射部位自我聚集，增强了局部光热效应。佐剂的免疫刺激特性，结合光热诱导的抗原释放，显著提高了肿瘤热免疫疗法的治疗效力。总的来说，这些原位聚集的疫苗在利用天然材料进行癌症免疫疗法方面具有巨大的潜力。

方案1. 螺旋藻骨架纤维自聚原位缠结增强抗肿瘤热免疫治疗效果示意图

【Au@E-SP的合成与表征】

研究人员首先通过乙醇灭活螺旋藻，保留了其螺旋结构和免疫活性，然后用这些螺旋藻纤维吸附Au³⁺离子，并在原位合成了具有光热效应的金纳米颗粒。通过原子力显微镜(AFM)观察了E-SP的细胞表面形态，并分析了其粗糙度，证实了细胞壁的显著破坏。通过紫外-可见光谱(UV-Vis)证实了金纳米颗粒的成功合成，并利用元素映射和透射电子显微镜(TEM)图像进一步确认了金纳米颗粒在E-SP上的均匀分布。X射线衍射(XRD)分析提供了金纳米颗粒沉积在E-SP上的证据。通过这些方法，成功地证明在螺旋藻骨架纤维上合成了金纳米颗粒，并且这种复合材料具有作为高效光热治疗剂的潜力。

图 1. E-SP和Au@E-SP的合成和表征

【注射E-SP形成3D疫苗支架】

接下来，探讨了通过注射螺旋藻骨架纤维(E-SP)形成3D疫苗支架的过程。首先假设具有螺旋结构的丝状E-SP在皮下注射后能够聚集和纠缠。为了测试这一假设，他们通过超声波处理E-SP获得了裂解的E-SP片段(L-E-SP)，作为对照组。实验观察到，E-SP在注射后能够形成小结节，并且由于其螺旋结构，E-SP在体内聚集后能够延长其保留时间，从而有利于持续的免疫刺激。此外，E-SP在体内形成3D支架的能力不受负载金纳米颗粒的影响。结果表明，螺旋藻骨架纤维(E-SP)在体内形成3D疫苗支架的能力，为癌症免疫疗法提供了一种新的策略。

图2. E-SP的体内自聚集

【Au@E-SP增强光热效应的评估】

研究者们评估了负载金纳米颗粒的螺旋藻骨架纤维(Au@E-SP)的增强光热效应。他们通过记录在不同浓度和功率密度下的温度变化，使用热成像相机来研究Au@E-SP的光热特性。结果显示，Au@E-SP表现出浓度和功率依赖的特性，并且在808 nm激光照射下，其最大温度可以达到58 °C，光热转换效率达到17.1%。此外，研究者们还观察到Au@E-SP在近红外(NIR)808 nm激光照射下，其局部温度变化(ΔT)是裂解的Au@E-SP(L-Au@E-SP)组的1.7倍。这一增强效应可以归因于E-SP的丝状和螺旋结构，这促进了Au纳米颗粒的原位聚集和纠缠。结果表明，Au@E-SP有望在注射部位集中Au纳米颗粒，从而增强局部光热强度。

图3.Au@E-SP的光热性能

【Au@E-SP诱导的体外肿瘤杀伤和免疫应答】

接下来，探讨了Au@E-SP在体外诱导肿瘤杀伤和免疫反应的能力。首先研究了螺旋藻骨架纤维(E-SP)是否能够逆转肿瘤微环境中的免疫抑制状态。通过与M2样巨噬细胞共培养，观察到诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的红色荧光强度显著增加，这是M1样巨噬细胞的标志。此外，与E-SP和Au@E-SP共培养后，细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放显著增加，这些细胞因子可以刺激后续的促炎性免疫反应。这些结果表明Au@E-SP可以调节肿瘤免疫抑制微环境并促进肿瘤杀伤。研究者们还调查了Au@E-SP处理的4T1乳腺癌细胞的存活率。活死细胞染色实验证实了Au@E-SP在近红外(NIR)照射下的杀伤效应。这些发现表明Au@E-SP通过光热效应杀死肿瘤细胞，并在体外诱导了强烈的免疫反应。

图 4. Au@E-SP的体外细胞毒性和免疫活性

【免疫刺激的体内评估】

为了评估了Au@E-SP在体内诱导免疫刺激的效果。作者首先在4T1乳腺癌小鼠模型中建立了肿瘤，并在肿瘤内注射了不同的制剂。为了未来的免疫分析，他们获取了肿瘤组织和肿瘤引流淋巴结。结果显示，与PBS组相比，E-SP组和Au@E-SP组的树突状细胞(DCs)成熟率略有增加，表明E-SP具有免疫佐剂效应。在NIR光照射后，Au@E-SP+NIR组的DCs成熟水平显著高于PBS和Au@E-SP组，分别增加了2.70倍和1.90倍。这表明光热诱导的免疫原性细胞死亡能够释放肿瘤自体抗原，并更好地促进DC成熟。研究者们还分析了肿瘤内T细胞的浸润情况，发现Au@E-SP+NIR组有效地促进了CD8⁺ T细胞的浸润，与PBS组相比增加了2.97倍。此外，免疫细胞的荧光染色显示，治疗后免疫抑制性微环境得到了逆转。结果表明，Au@E-SP不仅能够有效地消除肿瘤，而且对小鼠没有显著的毒性副作用，这表明疫苗支架在临床应用中具有巨大的潜力。

图 5. 不同组的体内免疫刺激

【抑制4T1原发肿瘤】

为了评估了Au@E-SP对4T1原发性肿瘤的抑制效果。作者首先在携带4T1肿瘤的小鼠中进行了不同处理，包括PBS、E-SP、Au@E-SP和Au@E-SP+NIR。与PBS组的快速肿瘤生长相比，E-SP和Au@E-SP组表现出适度的肿瘤抑制效果。值得注意的是，Au@E-SP+NIR组的肿瘤通过免疫刺激和热效应的结合完全消除。此外，Au@E-SP+NIR组小鼠的生存时间显著延长。研究者们还观察到，与健康小鼠相比，Au@E-SP+NIR治疗后的小鼠脾脏大小和重量没有显著变化，并且血液常规参数在正常范围内。这些结果表明，研究策略有效地治疗了携带4T1肿瘤的小鼠并促进了它们的恢复。具体来说，治疗后小鼠体重没有显著下降，血液生化参数没有明显变化，也没有观察到明显的器官损伤。

图 6. Au@E-SP的体内抗肿瘤功效

【预防术后4T1肿瘤复发转移】

作者探讨了Au@E-SP在手术后预防4T1肿瘤复发和转移的能力。在4T1皮下肿瘤模型上进行了不完全切除手术，并将小鼠随机分为四组(PBS、E-SP、Au@E-SP、Au@E-SP+NIR)。为了便于术后使用，E-SP和Au@E-SP在体外冻干形成支架，并植入手术部位。通过生物发光成像，研究者们发现Au@E-SP+NIR组的小鼠完全抑制了肿瘤复发。此外，Au@E-SP+NIR组的生存率达到了100%，而PBS组的所有小鼠在第30天死亡。治疗21天后，PBS组的小鼠脾脏重量是健康组的8.09倍，而Au@E-SP+NIR组的小鼠脾脏重量恢复到健康组的水平。研究者们还评估了术后对肝脏和肺部的转移。H&E切片图像显示，大多数组的肺部和肝脏中存在转移灶，而Au@E-SP+NIR组没有观察到这些现象。总之，这些结果证实了原位疫苗支架能够有效抑制肿瘤复发和转移，满足各种临床抗癌需求。

图 7. Au@E-SP植入物用于术后肿瘤复发和转移预防

【小结】

该研究利用螺旋藻骨架纤维独特的生物物理和生化特性，成功开发了一种原位疫苗支架(Au@E-SP)。该支架已证明具有增强肿瘤热免疫治疗的能力。通过利用螺旋藻的自我辅助特性，可以逆转肿瘤的免疫抑制微环境，促进M2巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞。此外，螺旋藻骨架纤维能够使Au@E-SP原位聚集和缠结，从而增强局部光热效应并促进后续的抗肿瘤免疫反应。作者相信Au@E-SP作为肿瘤治疗疫苗显示出巨大的前景，并具有未来的临床应用潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202312201