Cell：利用CRISPR/Cas9系统**标记发育大脑中的内源性蛋白
2016-05-15 佚名 生物谷 Bioon.com
在一项新的研究中，来自美国马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所（Max Planck Florida Institute of Neuroscience, MPFI）的Ryohei Yasuda博士和他的团队开发出一种被称作SLENDR的方法，这种方法允许对活组织样品中的神经元DNA进行精确修饰。利用这种新技术，研究人员能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们
在一项新的研究中，来自美国马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所（Max Planck Florida Institute of Neuroscience, MPFI）的Ryohei Yasuda博士和他的团队开发出一种被称作SLENDR的方法，这种方法允许对活组织样品中的神经元DNA进行精确修饰。利用这种新技术，研究人员能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实这种SLENDR方法真正地和准确地敲入基因。相关研究结果于2016年5月12日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing”。SLENDR的全称为CRISPR/Cas9介导同源重组修复对内源性蛋白进行单细胞标记 （single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPRCas9-mediated homology-directed repair）。
在这项研究中，研究人员努力理解当我们学习和形成记忆时，我们大脑中的细胞发生变化的方式。但是这个领域的研究受到限制的原因在于缺乏允许科学家们定位和可视化观察单个神经元内单个蛋白的技术。当前的成像方法并不提供足够强的特异性、对比度和分辨率来观察不同的蛋白。此外，这些成像方法耗时耗力而且成本高昂；它需要一到两年的时间开发基因改造模型。但是在研究员Jun Nishiyama博士和博士后研究员Takayasu Mikuni博士了解到DNA基因编辑技术CRISPR/Cas9后，他们有了新的想法。
CRISPR是一种存在于细菌DNA中的工具，这些单细胞有机体利用它来抵抗病毒感染。当病毒入侵和试图将它的传染性DNA插入到细菌细胞的DNA中时，细菌DNA中被称作CRISPR的特殊片段切割病毒DNA，使得后者不能够造成严重破坏。
科学家们已开始利用CRISPR/Cas9切割细胞和除细菌之外的有机体中的特异性基因。当这种切割产生时，细胞采用两种方法来修复它的DNA。一种方法是同源重组修复（homology-directed repair, HDR），另一种是非同源末端接合（non-homologous end joining, NHEJ）。HDR是更加准确的，重建或替换受损的基因，而NHEJ降解受损的基因，并将留下来的末端重新连接在一起，这经常会阻止受损基因的表达，但是不会替换它。
如果细胞利用HDR进行自我修复，那么科学家们能够往CRISPR系统中加入一种所需的基因，它将被插入到细胞DNA中替换受损的基因。不过，很多科学家们认为一旦细胞停止分裂，它通常采用NHEJ而不是HDR来修复任何断裂的DNA。
尽管CRISPR系统强大的基因编辑能力让人印象深刻，但是它很少在操纵脑细胞DNA中取得成功，这是因为在大脑形成时，它的细胞不再分裂。尽管科学家们能够利用CRISPR相对容易地敲除大脑中的某些基因，但是细胞分裂的缺乏使得他们很难通过HDR可靠地和精确地敲入所需的基因。
为此，Yasuda和他的团队开发出一种他们称之为SLENDR的方法，该方法能够被用来准确地修饰活组织样品中的神经元DNA。在实验性模型中，研究人员选择子宫内电穿孔技术，该技术允许他们将CRISPR/Cas9系统插入到仍然在发育和分裂的胎儿期脑细胞中。因此，发生断裂的DNA仍然通过HDR进行修复，这就允许研究人员导入一种能够在显微镜下可视化观察感兴趣蛋白的基因。他们甚至能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实这种SLENDR方法真正地和准确地敲入基因。
在测试这种新技术时，研究人员观察到蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）α亚型的一种之前未曾描述的行为。在发育早期，大约在出生7天后，PKC α亚型被发现在神经元细胞膜中簇集，这提示着它是高度有活性的，然而在出生一个月后，它在整个神经元中广泛地扩散，这提示着在发育后期，它不再是高度有活性的。
Yasuda说，“我认为SLENDR将是一种研究分子与细胞神经生物学的标准工具。SLENDR提供一种有价值的方法来确定蛋白的亚细胞位置，这将有助研究人员确定这些蛋白的功能。”
原始出处：
Takayasu Mikuni, Jun Nishiyama, Ye Sun, Naomi Kamasawa, Ryohei Yasuda.High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.Cell DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.044
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