Cell：突破极限！清华大学戴琼海/祁海/吴嘉敏开发新型双光子显微镜，能对深层组织进行长时间的3D成像

全面理解生理病理过程需要在多个空间和时间尺度上对深层组织进行无创3D成像，以将各种短暂的亚细胞行为与长期的生理发生联系起来。尽管双光子显微镜(TPM)应用广泛，但由于点扫描方案、累积光毒性和光学像差，在时空分辨率、成像体积和持续时间之间仍然存在不可避免的权衡。

2023年5月12日，清华大学戴琼海、祁海及吴嘉敏共同通讯在Cell在线发表了题为“Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue”的研究论文，该研究利用TPM中的合成孔径雷达的概念，在毫秒尺度上实现了亚细胞动力学的像差校正3D成像，深度组织中超过100,000个大体积，光漂白减少了三个数量级。

利用其优势，该研究发现了创伤性脑损伤后通过迁移体产生的直接细胞间通讯，可视化了小鼠淋巴结生发中心的形成过程，并表征了小鼠视觉皮层中的异质细胞状态，为活体成像在整体水平上理解生物系统的组织和功能开辟了一个视野。

对深层组织中细胞和亚细胞行为和功能的长期观察可以为病理学、免疫学、神经科学、细胞生物学和发育生物学提供宝贵的见解。由于双光子显微镜的长波长和深穿透的非线性特性，在过去的几十年里，随着各种动物模型的发展，双光子显微镜(TPM)取得了巨大的发现。然而，点扫描方案、累积的光毒性和光学像差导致了在时空分辨率、成像体积和成像时间之间不可避免的权衡，限制了对复杂生物现象在多个时空尺度上的全景理解。例如，很难在免疫反应或记忆形成的整个过程中跟踪细胞迁移或神经放电。将这些短暂的细胞或亚细胞动力学与长期的生理发病机制联系起来的工具发展可能有助于在整体水平上理解生物系统的基本组织和功能机制。

虽然已经开发了各种高速三维(3D)双光子显微镜，但这些方法要么需要高激光功率来产生多焦点，要么需要为特定应用(如定位或神经编码)产生时空稀疏先验。Bessel焦扫描TPM通过扩展景深(DOF)来快速采样大体积，同时牺牲轴向分辨率。此外，由于非线性响应，TPM对光学像差很敏感。尽管自适应光学(AO)可以通过提高分辨率和信噪比(SNR)来解决问题，但它需要一个额外的波前传感器或空间光调制器来估计和补偿散射组织或不完美成像系统中的波前畸变，这些系统通常由于空间非均匀像差而具有较小的有效视场(FOV)。因此，深层组织的长期高速高分辨率3D成像仍然是一个未解决的系统性挑战。

文章模式图（图源自Cell ）

为了解决这些问题，同时最大限度地减少光毒性，该研究提出了一种双光子合成孔径显微镜(2pSAM)，通过用针状光束捕获整个3D体的多个角度投影，而不是用高数值孔径(NA)的点扫描。该研究发现，2pSAM激光功率远低于先前所描述的安全阈值，而传统TPM在长期连续成像过程中也低估了累积的非线性光损伤。

2pSAM不仅可以实现深层组织毫秒级的亚细胞三维成像，显著降低光毒性(相当于比TPM慢1000倍以上)，而且对各种光学像差具有很强的鲁棒性。利用其功能，该研究确定了创伤性脑损伤(TBI)后通过迁移体进行的直接细胞间通信，可视化了免疫反应期间生发中心(GC)的完整形成过程，并揭示了小鼠在长达一小时的高速大规模神经记录过程中的异质细胞状态。

原文链接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00412-9#%20