流行性脑脊髓膜炎病1例

男性，14岁，学生

在学校集体宿舍居住，发病前10d外出史不详。2015年9月18日以“头痛、发热”为主诉收住郑州大学第二附属医院。

T39．5℃，皮肤有淤点和淤斑等症状，并且伴有颈项强直和意识障碍，克氏征和布氏征均为阳性。

血液中白细胞总数达到11．6×109个/L，中性粒细胞高达87%，脑脊液呈混浊状态。2015年9月20日死亡。1．2标本患者的脑脊液和血液，37例密切接触者的咽拭子和血液。1．3主要试剂及仪器脑膜炎奈瑟菌凝集血清购自ThermoFisher公司;2×PremixExTaq和dH2O均购自Takara公司。APINH生化鉴定试纸条购自法国生物梅里埃公司;A群和C群流脑多糖抗体IgG检测试剂盒购自郑州亿特生物技术有限公司;革兰氏染色液购自BASO公司;血培养瓶、双抗和无抗巧克力平板，均购自郑州安图生物工程有限公司;离心机购自Eppendorf公司;CO2培养箱购自ThermoFisher公司;MagNAPureLC2．0全自动核酸分离纯化系统购自Ｒoche公司;荧光定量PCＲ仪和酶标仪均购自Bio-Ｒad公司;普通显微镜CX41购自奥林巴斯。1．4细菌培养及血清学鉴定①将患者脑脊液沉淀接种于无抗巧克力平板，37℃5%CO2进行培养，24h后进行镜检和生化鉴定。②将患者血培养瓶置于37℃5%CO2进行培养，15h后取培养液涂于无抗巧克力平板再进行培养，24h后进行鉴定。③将37例密切接触者的咽拭子接种于双抗巧克力平板，培养24h，挑取可疑菌落接种于无抗巧克力平板继续培养，48h挑取无抗巧克力平板上的菌落进行镜检和生化鉴定。对确定为脑膜炎奈瑟菌的标本，通过血清凝集试验进行分群。1．5基因分型。1．5．1DNA提取按照使用说明书，通过MagNAPureLC2．0全自动核酸分离纯化系统对患者的脑脊液上清、血液和37例密切接触者的咽拭子进行DNA提取。1．5．2引物的合成引物和探针序列参照文献［7］，由上海生工生物工程有限公司合成。1．5．3PCＲ扩增及产物鉴定使用脑膜炎奈瑟菌属ctrA基因对患者和密切接触者提取的DNA进行检测，再使用流脑分群引物对阳性标本进行分群。荧光定量PCＲ反应体系:PremixExTaq(2×)10μL，上下游引物、探针各1μL，DNA模板2μL，dH2O补足20μL体系。以分别含有ctrA基因、C群特异性基因和B群特异性基因的DNA为阳性对照，dH2O为阴性对照。PCＲ反应程序:95℃2min，95℃5s，60℃20s，共40个循环，在60℃收集荧光信号。Ct值≤35判定为阳性。1．5．4多位点序列分型引物的设计参照PubMLST网站上公布的脑膜炎奈瑟菌7个保守基因(abcZ、adk、aroE、fumC、gdh、pdhC、pgm)的引物信息(http://pubmlst．org/neisseria/info/primers．shtml)。PCＲ扩增之后进行测序，测序结果上传到PubMLST数据库进行分析［2］。1．6密切接触者的抗体水平按照试剂盒说明书，用A群和C群流脑多糖抗体IgGELISA检测试剂盒对37例密切接触者的血清进行流脑A群和C群抗体水平检测。标准曲线以标准品质量浓度值为x轴，以标准品A450nm值的对数值为y轴，通过四参数Logistic曲线拟合建立标准曲线，根据待测样品的A450nm值回算相应的质量浓度值。质量浓度≥2μg/mL则为阳性，具有免疫保护水平。1．7统计学分析采用IBMSPSS19．0软件对37例密切接触者流脑A群和C群抗体水平进行Fisher精确检验，P＜0．05为差异有统计学意义。2.结果2．1细菌培养和鉴定镜检及生化鉴定结果显示，患者的脑脊液、血液和13号密切接触者的咽拭子标本均培养出脑膜炎奈瑟菌，其他36份密切接触者的标本均未见脑膜炎奈瑟菌生长。血清凝集试验结果显示，患者的脑脊髓液和血液均与C群血清凝集，13号密切接触者的咽拭子与B群血清出现凝集。2．2基因分型对于ctrA基因，患者脑脊液、血液和13号密切接触者扩增的Ct值分别为21、24和25;对于C群特异性基因，患者脑脊液和血液扩增的Ct值分别为24和26，13号密切接触者未扩增出曲线;对于B群特异性基因，13号密切接触者扩增的Ct值为28，患者脑脊液和血液均未扩增出曲线。这表明患者为C群脑膜炎奈瑟菌，13号密切接触者为B群脑膜炎奈瑟菌，与血清凝集试验结果一致。多位点序列分型结果显示，患者为ST4821型，13号密切接触者为ST5664型，两者均属于ST4821克隆群。2．3密切接触者的抗体水平A群流脑抗体阳性率较高，达91．89%，平均质量浓度为6．50μg/mL;C群流脑抗体水平阳性率相对较低，为21．62%，平均质量浓度为1．73μg/mL。A群抗体水平高于C群，差异具有统计学意义(P＜0．01)。