【衡道丨笔记】FISH技术注意事项

 一、FISH荧光原位杂交

应用荧光染料标记的DNA/RNA探针，根据碱基互补配对的原则，与变性后的染色体或细胞核靶核酸杂交，在荧光显微镜下观察并记录结果。

 二、FISH的工作原理

• 基因组DNA由两条互补分子链相结合组成；

• 为使探针能结合，双链DNA需要加热变性解链；

• 探针在杂交过程中与其互补序列相结合；

• 结合的探针通过荧光显微镜观察。

操作流程简图

确定读片区域——低倍到高倍

• 10x：切片位置、确定观察区域；

• 40x：扫描观察区域，观察背景、异质性，信号点强度和形状、选择计数区域；

• 100x：扫描计数区域、选择计数细胞，分辨信号并计数。

确定观察区域

选择计数细胞——细胞核选择

• 大小：较大

• 胞核边界完整

• DAPI染色均一

• 细胞核无重叠

• 信号清晰及可读

• 使用双探针时，只计数每种颜色FISH信号≧1的细胞

结果描述

• 评估肿瘤细胞数量

• 肿瘤异质性评价

• 信号描述：点状、簇状，比值

• 分离探针：分离信号所占比例

 三、FISH注意事项

1、检测前:

样本前处理标准化：

• 尽快取材固定；

• 4%中性缓冲甲醛（甲醛与氧化性物质接触后形成的甲酸，可改变环境pH；中性缓冲型甲醛固定剂能有效中和甲醛氧化生成的甲酸，使环境pH得以稳定）；

• 4-6μm切片厚度；

• 切片<6周，蜡块<2年；

• 盐酸脱钙影响杂交；

标本处理不当

• 固定时间6-48小时；

• 经过福尔马林固定后的交联会限制探针和试剂，使它们不能接近目的核酸。

福尔马林固定时间越长，发生交联的程度越高

2、检测中:

（1）抗原修复

去离子水：高温90℃（20-30min）；高压煮沸（10min）

柠檬酸盐缓冲液pH6.0：高温90℃（20-30min）；高压煮沸（10min）

EDTA缓冲液：高温90℃（20min）

（2）酶消化

胶原酶：1mg/ml

胃蛋白酶：低浓度20mg/ml（20min-1h）；高浓度250mg/ml（1-10min）

蛋白酶K：200μg/ml（5-8min）

（3）变性 杂交

变性：73℃-85℃ 5-8min

孵育过夜：37℃-42℃ 16h（过夜湿度保持恒定）

检测后：

判读；报告；资料保存

 四、总结

高质量的FISH结果：

• 仪器设备维护

• 熟悉病理组织学特点

• 操作人员规范培训

• 掌握实验优化条件