【衡道丨笔记】常规技术对分子病理检测与诊断的影响

内容摘要

一、病理检查流程

二、固定及取材影响因素

固定目的

1.保持离体组织细胞的形态；

2.细胞内特殊物质定位；

3.保持细胞内抗原、DNA及RNA；

4.硬化组织有利于切片；

5.便于对细胞内不同成分区别。

影响因素

固定：

• 标本离体是否在一个时间点及时固定；

• 固定剂的重要特征——可使蜡块的HE染色保持高质量和一致性，无论在初始还是在保存10年后；

• 固定的方法；

• 固定的时间与标本的大小。

取材：

• 组织取材厚度及大小；

• 小标本取材用相应材料包裹；

• 脱水盒中组织放置方向；

• 去除组织内杂物；

• 骨组织及钙化组织脱钙；

• 脱钙标本脱钙时间或流水冲洗时间；

• 标本是否干涸。

三、组织处理影响因素

全自动脱水机注意事项

• 选择程序；

• 开机前检查试剂液面；

• 开机前擦拭探头；

• 脱水篮放置平稳；

• 不可擅自更改脱水程序；

• 发生问题时判断原因，不能随意处理；

• 运行机器时不能误操作；

• 使用试剂及时更换；

• 更换试剂时位置更换准确；

• 更换试剂后设置全部试剂状态；

• 在开机前对机器做简单维护；

• 开机后再检查机器运行状态。

四、包埋流程影响因素

• 包埋前应清理台面上残留组织碎屑；

• 使用的包埋模具应清洁；

• 准确判断包埋面；

• 按要求进行包埋；

• 发现问题及时和取材医师沟通反馈。

五、石蜡切片流程影响因素

毛笔：洁净、无蜡屑、无异物；

弯镊：洁净、无蜡屑、无异物，必要时使用无水乙醇擦拭；

一次性刀片：锋利、无缺口；

载玻片：洁净、无油腻、无水渍及污物；

载玻片打号机：用于打印相应蜡块的病理编号于载玻片上；

轮转式切片机：人工、半自动或全自动；

冷冻台：用于切片前的蜡块冷却，使蜡块维持一定的切片硬度；

漂片仪/水浴锅：用于蜡片的漂片展平；

烤片机/烤箱：用于切片的烘烤和沥水。

六、分子病理检测切片影响因素

• 及时登记（蜡块、申请单）、及时归档（蜡块、HE等）；

• 及时清洁切片台面；

• 准备干净的载玻片；

• 切片工具的清洁；

• 脱蜡试剂要定期更换；

• 每天一次清洗水浴锅；

• 切每个标本更换刀片，用75%酒精进行刀架消毒，防止污染；

• 写片时，要写全关联医嘱的病理号，包括年份和蜡块小号，肿瘤区域富集细胞等，方便后续切片评估和核对蜡块；

• 有问题及时与诊断医生沟通（指标,小号与免疫组化不一致）。

七、HE染色影响因素

烤片：烤片时间需充分，防止在染色过程中发生脱片；

脱蜡：脱蜡要彻底，防止染色时切片不易着色；

胞核染色：①苏木素染核 ②盐酸酒精分化 ③蓝化.；

胞浆染色：伊红染胞浆；

脱水：梯度酒精脱水；

透明：透明要彻底。

八、分子病理检测三大主流技术

• FISH

• 测序技术：Sanger测序、NGS

• PCR：qPCR/RT-qPCR、ARMS、ddPCR

FISH操作影响因素

组织固定不充分，FISH预处理时组织脱落，镜下可见细胞呈“棉絮状”或“软团块状”。组织固定过度，可能导致样本蛋白等大分子物过度交联，镜下“细胞核可见空洞、DAPI过分均质”

二者都可能出现信号减弱或无信号。

切片太薄（实际厚度＜3μm），容易消化过，具信号出现很大比例的丢失，影响结果判读；

切片太厚（实际厚度>5μm），难于消化，容易出现高背景，信号层面增多影响观察判读。

脱蜡不足：后续实验步骤都无法补教，导败背景高甚至探针杂交失败。脱蜡使用的二甲苯需经常更换，并可根据实际情况延长脱蜡时间。

石蜡样本基因提取要点总结

1、样本评估、优化流程：

选取瘤细胞丰富，无坏死、粘液、软骨区域。

珍惜穿刺小标本，HE切片同时或初诊后及时留取组织蜡片优先保证分子检测。

2、严格消毒、蜡片量适当：

单人单刀口，75%酒精彻底消毒刀架、镊子等。操作者带口罩、手套。

5μm厚蜡片大块组织2-4张，小组织5-8片。组织量不宜过多。

3、脱蜡彻底、酶解完全

二甲苯脱蜡3次，13000x3min/次

蛋白酶K裂解完全（56℃），胶原等组织少量残余不影响后续检测，推荐水浴，可过夜，酶解时间长可获得更长的片段。

4、根据样本调整洗脱液量

通过调整DNA洗脱液量间接调节DNA浓度（小标本）

PCR上样时，直接用脱液稀释模板>100ng/μl，倍比稀释。

注：低盐高pH洗脱

ARMS结果判定注意点

 九、总结

常规技术流程繁琐、制作过程需要操作精细，每一步操作都可能影响到后续的质量；是做出准确病理诊断的关键。