Nature子刊：陆艺团队开发糖基化RNA原位成像方法ARPLA

2021年，诺奖得主、斯坦福大学 Carolyn Bertozzi 教授团队和哈佛大学 Ryan Flynn 教授首次发现了一种被聚糖（glycan）修饰的RNA分子，名为糖基化RNA（glycoRNA）。这种分子由修饰了含有唾液酸的聚糖的小RNA构成，能够与唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素（siglec）进行相互作用，显示出其可能的重要生理功能。

然而，迄今为止，由于缺乏有效且特异性的成像技术，对糖基化RNA的研究受到了限制，我们对这种分子的了解仍然非常有限，例如其在细胞内的分布、生理作用以及与疾病的关联仍尚未明确。

2023年5月22日，德克萨斯大学奥斯汀分校陆艺教授团队在 Nature Biotechnology期刊发表了题为：Spatial imaging of glycoRNA in single cells with ARPLA 的研究论文。

该研究开发了一种名为ARPLA（唾液酸适配体和RNA原位杂交介导的邻位连接技术）的糖基化RNA原位成像方法。该方法首次实现在细胞内直接原位观测糖基化RNA，并具有极高的灵敏度和特异性。ARPLA可用于观察细胞中的糖基化RNA，揭示其在细胞内的分布，并能灵敏捕捉到其在疾病和生理过程中的变化情况。

陆艺教授课题组利用邻位连接技术（proximity ligation assay）开发糖基化RNA原位成像技术ARPLA（图1）。该方法通过核酸适配体（aptamer）、原位杂交技术（in situ hybridization）实现对糖基化RNA的聚糖和RNA部分的双重识别，然后利用DNA邻位连接技术，生成完整的环状DNA，作为滚环扩增的模板，产生长序列单链DNA。然后，该DNA产物通过互补的荧光团标记的探针DNA杂交，用于提供糖基化RNA的位置和丰度信息。该方法首次实现了高灵敏性的糖基化RNA成像，具有较高的选择性和特异性，是研究糖基化RNA在不同细胞类型中的空间分布和相对丰度的有力工具。

图1. ARPLA技术路线及工作原理

通过ARPLA，研究人员首次在亚细胞水平上观察到了糖基化RNA的分布。脂筏（lipid rafts）是许多信号受体锚定的关键细胞膜微域，研究人员发现糖基化RNA主要分布在细胞膜上，并与脂筏共定位（图2）。几十年来，蛋白质和脂质上的聚糖对于细胞和细胞病原体之间的交流至关重要。ARPLA为探索糖基化RNA与脂质筏锚定受体之间的相互作用提供了有价值的线索。与此同时，在细胞内，糖基化RNA定位于SNARE蛋白包裹的脂质囊泡中，表明糖基化RNA内的运输途径是通过SNARE介导的膜融合和胞外作用。 

图2. 糖基化RNA与脂伐共定位

为了探索糖基化RNA与疾病的潜在关联，研究人员探究了健康乳腺细胞和乳腺癌细胞中糖基化RNA丰度的差异。此前，科学家们在多种癌症类型中发现了唾液酸高表达现象。然而，此次研究中发现糖基化RNA呈现出相反的趋势。在健康细胞中，研究人员发现糖基化RNA的丰度最高，而随着癌症的进展、迁移，糖基化RNA的丰度会显著下降。这一发现表明糖基化RNA具有独特的调节途径，这与糖蛋白和糖脂的规律有所区别，进一步揭示了糖基化RNA在维持身体健康状态中的独特作用。

图3. 糖基化RNA在癌症进展过程中丰度下降

在另一个重要的生物学模型中，研究人员发现免疫细胞的发育成熟会导致表明糖基化RNA水平的降低。引人注目的是，一旦细胞受到细菌抗原脂多糖（LPS）的刺激，糖基化RNA水平会显著增加。这表明在炎症反应过程中，糖基化RNA在抗细菌侵染免疫反应中扮演着重要角色。这些重要的发现凸显了ARPLA在揭示糖基化RNA的生理性质极其重要生物学作用方面的强大实用性。 

ARPLA是首次实现了糖基化RNA的细胞内原位成像，并具有高灵敏性和高特异性。它无需代谢标记预处理，ARPLA可以实现在各种类型的样品中用于观测天然未标记的糖基化RNA。此外，该方法可以通过简单地改变ARPLA探针的RNA识别序列来实现几乎任何糖基化RNA的成像。 

未来，研究人员可以进一步优化ARPLA以产生更高的信号强度和分辨率，并设计用于检测活细胞中的糖基化RNA。在不久的将来，ARPLA可以成为研究糖基化RNA在各种生物系统中的作用的宝贵工具。 

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01801-z