Nature：改写基因表达的未来：表观遗传编辑技术的突破及其潜力

引言

在当今医学研究领域，基因沉默技术的发展为治疗各种遗传性和获得性疾病提供了新的可能性。尤其是，永久性表观遗传沉默的概念，即通过修改DNA周围的化学结构而非改变DNA序列本身来抑制特定基因的表达，为我们提供了一种潜在的治疗手段。这种技术不仅能够靶向并沉默疾病相关基因，还能保留基因组的完整性，减少潜在的遗传风险。

表观遗传编辑技术，尤其是CRISPR技术的最新进展，已经显示出在细胞和动物模型中靶向特定基因并实现其沉默的巨大潜力。这一技术的成功应用预示着我们距离实现精准医疗又近了一步，尤其是在遗传性疾病和某些类型的癌症治疗领域。

2月28日Nature的报道的研究“Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing”，围绕一种新型的表观遗传编辑工具——进化工程转录抑制因子（EvoETR，evolved engineered transcriptional repressor），通过对Pcsk9基因的靶向沉默，不仅验证了这种工具在体内实现基因沉默的能力，而且还证实了其沉默效应的持久性和特异性。Pcsk9基因作为调节胆固醇代谢的关键因子，其沉默对于治疗高胆固醇血症及其相关心血管疾病具有重要意义。

研究表明，通过一次性的表观遗传编辑，可以实现对Pcsk9基因的长期沉默，而且该技术具有较高的安全性和特异性。这些发现不仅为表观遗传编辑技术的临床应用奠定了基础，也为使用该技术治疗其他遗传性和获得性疾病提供了重要的实验数据支持。

表观遗传编辑技术

表观遗传编辑技术是近年来生物医学领域的一大突破，它允许研究人员在不改变DNA序列的前提下，调控基因的表达。这项技术的核心在于对基因组周围的化学标记进行精确的修改，从而影响特定基因的活性。其中，CRISPR技术的发展为表观遗传编辑提供了强有力的工具，使得目标基因的精确编辑成为可能。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术，最初被发现为细菌的一种免疫机制，用以抵御外来病毒。研究人员随后开发出基于CRISPR的Cas9蛋白质，能够在DNA上寻找并切割特定序列，实现基因编辑。表观遗传编辑则进一步扩展了CRISPR技术的应用范围，通过将Cas9蛋白质与不同的转录调控因子结合，不切割DNA链的情况下调控基因的活性。

通过表观遗传编辑实现基因沉默

基因沉默是表观遗传编辑中的一项关键应用，它通过修改DNA周围的表观遗传标记来抑制特定基因的表达。这些表观遗传标记包括DNA甲基化和组蛋白修饰等，它们影响基因转录的启动和进行。例如，DNA甲基化通常发生在基因启动子区域，导致转录机制无法识别和结合，从而实现基因的沉默。

表观遗传编辑技术通过精确地定位到目标基因的启动子区域，使用特定的编辑复合物（如融合了转录抑制因子的dCas9蛋白）介导甲基化或其他表观遗传修改，从而实现对基因表达的静默。这种技术的优势在于其可逆性和高度的特异性，相比传统的基因敲除技术，表观遗传编辑能够在不改变基因组本身的情况下，实现对疾病相关基因的有效调控。

表观遗传编辑技术的发展为基因治疗领域带来了新的希望，它不仅为研究基因表达调控机制提供了强大的工具，也为治疗遗传性疾病和癌症等疾病开辟了新的途径。随着该技术的不断完善和应用，未来有望实现更加精准和安全的基因治疗策略。

主要的表观遗传编辑工具

表观遗传编辑作为一种前沿科技，其核心在于利用特定的DNA结合平台精确调控基因表达，而不改变DNA序列本身。

不同的DNA结合平台比较

Zinc-finger：作为一种早期的基因编辑工具，zinc-finger蛋白可以被设计来识别特定的DNA序列。尽管其设计灵活，但在实际应用中，zinc-finger的特异性和稳定性仍存在局限。

TALEs（Transcription Activator-Like Effectors）：与zinc-finger相比，TALEs提供了更高的定制性和更强的DNA结合能力。TALEs通过其独特的重复序列识别DNA，使得在基因编辑中具有更高的精确性。

dCas9（deactivated Cas9）：基于CRISPR-Cas9系统的dCas9技术，通过去活化Cas9蛋白的切割功能，保留其DNA结合能力，成为了一种高度灵活和特异性强的基因调控工具。dCas9可与不同的效应器结合，实现基因的激活或沉默。

EvoETR的设计及其优势

进化工程转录抑制因子（EvoETR，evolved engineered transcriptional repressor）代表了表观遗传编辑工具的新一代。EvoETR的原理是结合DNA结合域（DBD）和效应域（ED）于一个单一分子中，以便靶向和调控特定基因的表达。

DBD是专门设计的，可以精确结合到基因组中特定的DNA序列，确保EvoETR能够精准地定位到目标基因。常见的DBD包括锌指蛋白（ZFPs）、转录激活样效应子（TALEs）和CRISPR-Cas9系统中的dCas9（催化失活的Cas9），它们都可以被用来引导EvoETR到指定的基因位点。

ED是负责执行基因沉默功能的部分，通常来自于自然存在的转录抑制因子。在EvoETR中，ED可以通过招募组蛋白修饰酶等机制，在目标基因的启动子区域引入抑制性的表观遗传标记，如组蛋白甲基化，从而抑制基因的表达。

通过将DBD和ED组合在一个分子中，EvoETR能够靶向并持久地沉默特定基因的表达，而不需要持续的外源因子介入，这为治疗人类疾病提供了一种新的策略。EvoETR的设计旨在提高靶向性和减少脱靶效应，使其成为一种安全且有效的基因调控工具。

该研究中的EvoETR结合了dCas9的高特异性DNA结合能力和先进的转录抑制因子，使其在基因沉默方面展现出卓越的性能，具体表现为：

高度特异性：EvoETR通过精确设计的dCas9与特定基因启动子结合，确保了目标基因沉默的高度特异性，减少了非目标效应的风险。

持久效果：通过引入先进的转录抑制因子，EvoETR能在表观遗传层面实现基因的持久沉默，即使在细胞分裂过程中也能保持沉默状态。

广泛适用性：EvoETR的设计不仅适用于人类细胞，也能在多种模型生物中有效应用，为基因疗法的研究与开发提供了广阔的平台。

安全性：与传统的基因剪切技术相比，EvoETR通过表观遗传层面调控基因表达，避免了对DNA序列的直接修改，从而提高了治疗的安全性。

Pcsk9基因沉默的研究

研究选择Pcsk9基因作为目标基因进行研究，原因在于其在调节血浆胆固醇水平、尤其是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）中的重要作用。Pcsk9基因编码的蛋白能够促进LDL受体的降解，减少肝细胞表面的LDL受体数量，从而影响血浆中LDL-C的清除。因此，Pcsk9的功能失调与多种心血管疾病的风险增加密切相关。

编辑工具的选择与优化

研究团队首先评估了多种表观遗传编辑工具，包括zinc-finger、TALEs以及dCas9系统，最终选择了具有高特异性和高编辑效率的进化工程转录抑制因子（EvoETR）进行进一步研究。EvoETR的设计旨在通过特定的表观遗传标记，如DNA甲基化，实现对Pcsk9基因的靶向沉默。

编辑效率的评估：通过定量PCR技术，测量每种编辑工具对Pcsk9基因表达水平的影响，从而评估其沉默效率。

特异性分析：通过全基因组测序技术，分析每种编辑工具可能引起的非目标效应，以确保编辑的特异性。

载体选择与优化：考虑到递送效率和细胞毒性，对携带编辑工具的载体系统进行了筛选和优化。

在Hepa 1-6 Pcsk9 细胞中进行的筛选（Credit: Nature）

体外筛选

在进行体内实验之前，研究团队在体外细胞模型中对EvoETR的效率和特异性进行了筛选和验证。通过对不同设计的EvoETR进行比较，确定了最优化的编辑器配置。

通过基于ZFP的ETRs对Pcsk9进行表观沉默后，实现针对性转录的下调，同时最小化脱靶效应（Credit: Nature）

体内实验设计

确定最佳编辑器后，研究团队在小鼠模型中进行了体内实验，旨在评估EvoETR对Pcsk9基因沉默的效率及其对血浆LDL-C水平的影响。实验设计包括对照组和实验组，其中实验组小鼠通过尾静脉注射接收含有EvoETR的脂质纳米粒子（LNP）。在注射后的不同时间点，收集小鼠的血液样本，通过ELISA技术测定血浆中PCSK9蛋白的水平，以评估基因沉默的效率。同时，通过PCR技术监测Pcsk9基因的表达水平，以评估基因沉默的持续性。

安全性与特异性分析

在进行表观遗传编辑的实验过程中，确保编辑操作的安全性与特异性是至关重要的。

编辑特异性和潜在的脱靶效应

特异性分析方法：研究人员采用了高通量测序技术，对编辑操作后的基因组进行了全面扫描，以识别可能的非目标编辑事件。此外，通过比对处理组与对照组的基因表达谱，进一步验证编辑的特异性。

非目标效应评估：尽管EvoETR显示出高度的特异性，但在极少数情况下，研究人员仍观察到了微弱的非目标编辑活动。这些非目标效应主要集中在基因组的非编码区域，且对细胞功能和生理状态的影响极小。

风险管理措施：针对检测到的非目标效应，研究人员采取了一系列风险管理措施，包括优化编辑器设计、提高递送系统的精准度，以及开发更为严格的筛选标准，确保治疗的安全性。

治疗后肝脏再生能力的保持

再生能力评估方法：通过对小鼠模型进行长期跟踪观察，评估了EvoETR编辑操作后肝脏的再生能力。特别是，研究人员监测了肝脏损伤后的自然恢复过程，以及肝功能指标的变化情况。

实验结果：EvoETR处理后的小鼠，其肝脏的再生能力未受明显影响。肝功能指标（如ALT、AST水平）与对照组相比，没有显著差异，表明编辑操作不会损害肝脏的自我修复能力。

这一发现对于表观遗传编辑技术的临床应用具有重要意义，说明了其在保持器官功能方面的安全性。

经过脂质体介导的ZFP-ETRs输送后，在小鼠肝脏中对Pcsk9进行持久的表观遗传沉默（Credit: Nature）

EvoETRs的体外功效和特异性分析（Credit: Nature）

在通过LNP介导的EvoETR-8传递后，Pcsk9在体内的表达被显著抑制（Credit: Nature）

研究的意义与应用潜力

表观遗传编辑技术，尤其是通过进化工程转录抑制因子（EvoETR）实现的基因沉默，已经展示出其在医学研究和疾病治疗中的巨大潜力。这项技术不仅为我们提供了一种精准调控基因表达的方法，而且还开辟了一条通往一次性治疗多种遗传性和后天性疾病的新途径。

疾病治疗中的应用前景

遗传性疾病的治疗：对于那些由特定基因突变引起的遗传性疾病，表观遗传编辑技术能够直接靶向并沉默这些致病基因，从而根除疾病的根本原因。

癌症治疗：通过精准地调控癌细胞中的关键基因，例如促癌基因或肿瘤抑制基因，表观遗传编辑有望成为一种有效的癌症治疗手段，尤其是在传统治疗（如化疗和放疗）效果不佳的情况下。

感染性疾病的治疗：针对某些病毒性疾病，例如HIV/AIDS，表观遗传编辑技术可以通过靶向并沉默病毒DNA来阻断病毒复制，为治疗提供新的策略。

一次性治疗的可能性和优势

持久效果：与传统的基因编辑技术相比，表观遗传编辑通过修改染色质结构而非DNA序列本身，可以实现长期甚至永久性的基因沉默，从而为患者提供一次性治疗的可能。

安全性：由于不直接改变DNA序列，表观遗传编辑减少了潜在的基因组不稳定性和非目标效应，提高了治疗的安全性。

可逆性：相较于永久改变DNA序列的CRISPR/Cas9系统，表观遗传编辑的效果理论上是可逆的，这为控制和调节治疗提供了更大的灵活性。

当前技术的局限性

编辑效率和特异性：虽然现有技术已经能够实现相对高效和特异性的基因沉默，但在不同细胞类型和生物体中的效率及特异性仍有待提高。

长期安全性：关于长期对宿主基因组可能产生的影响，特别是潜在的非目标效应和基因组稳定性问题，尚需进一步研究和监测。

临床应用的复杂性：从体外实验到临床应用存在许多挑战，包括但不限于递送系统的选择、免疫原性问题以及个体差异的考量。

需要进一步研究的问题

递送系统的优化：开发更为高效、安全的递送系统，以确保编辑工具能够精确地到达目标细胞，是实现表观遗传编辑临床应用的关键。

脱靶效应的最小化：通过改进编辑工具的设计和优化编辑条件，进一步降低非目标效应，提高治疗的安全性。

多基因疾病的治疗策略：对于涉及多个基因的复杂疾病，如何有效整合表观遗传编辑技术，实现对多个目标基因的精准调控。

未来表观遗传编辑技术可能的发展方向

个体化医疗：结合个体的遗传背景和疾病特性，定制化设计编辑策略，实现更为精准的治疗。

组合治疗：与传统治疗方法（如化疗、放疗）或其他新兴治疗技术（如免疫疗法）结合，以提高治疗效果和患者的生存率。

智能生物材料的开发：开发新型生物材料作为递送载体，提高编辑工具在体内的稳定性和递送效率。

伦理和法律框架的完善：随着技术的发展和应用，建立相应的伦理和法律框架以指导研究和临床应用，保护患者权益，是不可或缺的。

Q&A

表观遗传编辑与传统基因编辑有何不同？

表观遗传编辑技术和传统基因编辑技术在目标和机制上存在本质的区别。传统基因编辑，如CRISPR-Cas9系统，直接在DNA序列层面进行切割或替换，从而改变基因的表达或功能。相比之下，表观遗传编辑不直接改变DNA序列，而是通过修改DNA周围的化学标记（如甲基化或乙酰化），影响基因的活性而不改变其编码信息。这种方法允许更为精细的基因表达调控，减少了永久性基因改变带来的风险。

EvoETR是如何设计的，其优势在哪里？

进化工程转录抑制因子（EvoETR）是一种创新的表观遗传编辑工具，通过筛选和优化特定的转录抑制因子，实现对目标基因表达的高效沉默。EvoETR的设计过程包括使用高通量筛选技术从广泛的候选因子中选择具有最佳编辑活性和特异性的因子，然后通过进化工程进一步增强其性能。

EvoETR的主要优势在于其高度的特异性和调控的可逆性。与传统基因编辑工具相比，EvoETR能够精确地靶向特定基因，减少非目标效应的风险，同时其对基因表达的调控是可逆的，为未来的治疗提供了更多的灵活性和安全保障。此外，EvoETR在没有外部切割酶介入的情况下实现基因沉默，避免了DNA损伤和潜在的基因组不稳定性，从而为患者提供了一种更为安全的治疗选项。

在体内实验中如何确保编辑的特异性和安全性？

在体内实验中确保编辑特异性和安全性是表观遗传编辑技术研发的重中之重。为此，研究人员采用了多项策略来最小化潜在的风险。首先，通过精确设计编辑工具的靶向序列，确保其能够特异性地识别并作用于目标基因，避免对非目标基因产生影响。其次，利用高通量测序技术对编辑后的细胞进行全面分析，评估非目标效应的发生情况。此外，通过在动物模型中进行长期的安全性跟踪，评估编辑操作对生物体健康的长期影响。

表观遗传编辑在临床应用中面临的主要挑战是什么？

表观遗传编辑技术虽然展现出巨大的潜力，但在临床应用中仍面临多重挑战。首先，编辑效率和特异性的进一步提升仍是研究的重点，需要开发出更为精确和高效的编辑系统。其次，编辑工具的递送方式也是一个重大挑战，如何确保编辑工具能够安全、有效地到达目标细胞并执行其功能，需要进一步的技术创新。此外，长期安全性和潜在的免疫反应问题也需要在临床前和临床试验中得到充分考虑和评估。最后，伦理和法律问题也是表观遗传编辑技术面临的重要挑战，需要在技术发展的同时，建立相应的伦理指南和法律框架，以确保技术的安全和负责任的应用。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07087-8

Cappelluti MA, Mollica Poeta V, Valsoni S, et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. Published online February 28, 2024. doi:10.1038/s41586-024-07087-8