重磅揭示：养阴活血汤抗肝纤维化机制原来是这个！抗纤维化新药方向有了

肝纤维化（HF）是机体对肝炎病毒、酒精、代谢和遗传、免疫异常和其他病因引起的慢性肝损伤的修复反应。其主要表现为肝组织细胞外基质（ECM）过度增殖和沉积，导致肝组织结构异常改变，扰乱肝脏生理功能。HF是一个严重的公共卫生问题，可导致肝硬化，肝癌和死亡。近年来，HF在中国乃至全球的发病率居高不下，并向各阶段人群扩展，呈逐年上升趋势。目前，尚无抗纤维化药物被临床批准用于人类。因此，开发高效、安全的抗肝纤维化药物并阐明其作用机制具有巨大的社会价值。

中医药治疗肝纤维化有其独特的优势。中药复方养阴活血汤（YYHXD）是根据温病条辨创立的治疗肝纤维化的方子，具有长期的临床和实践经验。YYHXD由白芍、柴胡、陈皮、赤芍、川芎、大黄、大枣、丹参、当归、黄芩、甘草、地黄、紫茎泽兰、浙贝母十四味药味组成。前期研究表明，YYHXD可以改善大鼠肝纤维化，但其治疗肝纤维化的药理学分子机制尚未阐明。

近期，研究者在《AGING》杂志发表了一篇标题为“Yangyinghuoxue decoction exerts a treatment effect on hepaticfibrosis by PI3K/AKT pathway in rat model: based on the networkpharmacology and molecular docking”的文章，通过网络药理学分析结合实验验证，明确了YYHXD可通过抑制PI3K/Akt的激活，从而发挥抗氧化和抗凋亡的作用缓解肝纤维化的药理作用机制。

图1 论文首页

靶点的收集

研究者通过TCMSP数据库和文献检索，共筛选出141个YYHXD活性成分（表1）。然后从SwissTargetPrediction数据库和Drugbank数据库中获得634个相应的靶点。此外，从网络数据库和文献中检索到1175个与HF相关的靶基因。Venn图显示药物相关靶点和HF相关靶点的交集（图2A）。根据Venn图，共识别出69个重叠基因。

“中药-成分-靶点-疾病”网络分析

YYHXD的“中药-成分-靶点-疾病”网络是通过整合药物-疾病重叠靶点及其对应的活性成分和中药构建的。如图2B所示，“中药-成分-靶点-疾病”网络包含224个节点（代表14种中药，141种化合物和69个靶点）和490条边（表示节点之间的相互作用）。通过进行拓扑分析，从“中药-成分-靶点-疾病”网络中筛选出了5种具有最高度得分的化合物，并依次排列如下：槲皮素、洋川芎醌、川芎萘呋内酯、亚油酸乙酯、杨梅酮，它们可能在网络中发挥关键作用（见表2）。

PPI网络分析和功能富集分析

研究者使用BisoGenet插件，对69个重叠靶点进行PPI分析。在度≥2倍中位数的两次筛选后，最终构建了PPI网络（图2C）。PPI网络包含200个节点和2768条边。CytoHubba使用MCC算法鉴定的前10个中枢基因是：TP 53、ACTB、HSP 90 AA 1、MYC、Akt 1、CTNNB 1、EP 300、MDM 2、JUN、RPS 27 A（图2D（a-f））。提示这些中枢基因可能是YYHXD治疗肝纤维化的关键靶点。

研究者利用MCODE软件从PPI网络中选择4个模块。Cluster 1是MCODE得分最高的模块，因此被认为是PPI网络中最关键的模块。Cluster 1是一个包含所有中枢基因和其他基因为核心的基因簇，共有34个基因和494条边。Cluster 1中的模块化基因被选择用于后续的功能富集分析（见图2D（a-f））。

为了研究Cluster 1中模块化基因的生物学特性，研究者进行了GO注释和KEGG通路分析。GO分析表明，34个模块化基因在BP术语、106个CC术语和132个MF术语中富集（P < 0.05和FDR <0.05）。BP参与细胞对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、细胞对活性氧的反应、对活性氧的反应等。

值得注意的是，与氧化应激相关的生物过程被广泛富集。CC术语包括转录调控复合物、RNA聚合酶II转录调控复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、纺锤体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等。MF术语中，常见靶点多富集在DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、激活转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合等方面。图2E显示了GO注释的三个类别中的前10个术语。

此外，34个模块化基因还富含在多种KEGG通路中，如JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞周期、FoxO信号通路、细胞凋亡等。图2F(a，b)和表3显示了最显著富集的前10个KEGG信号通路。在本研究中，研究者重点研究了PI3K-Akt信号通路，并进行了后续的分子对接和动物实验，以证明PI3K-Akt信号通路是YYHXD抗肝纤维化作用的重要机制。

分子对接验证

研究者选取了“中药-靶点-疾病”网络中的5个关键活性分子（槲皮素、洋川芎醌、川芎萘呋内酯、亚油酸乙酯、杨梅酮）和PI 3 K-Akt通路中富集的中枢基因靶蛋白（MYC、TP 53、Akt 1、HSP 90 AA 1）进行了分子对接验证。分子对接结果显示，YYHXD中的5个关键活性分子与PI 3 K-Akt通路相关蛋白具有较好的匹配性。以LibDock评分表示的结合亲和力见热图（图2G（e））。图2G（a-d）显示了靶蛋白（槲皮素、洋川芎醌、川芎萘呋内酯、亚油酸乙酯、杨梅酮）及其最相关的关键配体化合物的代表性分子对接结果。分子对接结果提示，YYHXD可能会对PI 3 K-Akt信号通路产生直接影响。

图2 网络药理学分析

YYHXD减轻肝纤维化大鼠肝组织病理学改变

研究者通过HE和Masson染色观察肝组织形态学变化，结果见图3A。在对照组中，肝脏组织显示正常的小叶结构和细胞结构。CCl₄模型组肝组织小叶结构紊乱，肝细胞肿胀坏死，炎细胞浸润，脂肪变性，且有假小叶形成。与模型组相比，YYHXD和秋水仙碱组上述变化不明显。结果提示，YYHXD能减轻CCl₄诱导的大鼠肝纤维化程度。

YYHXD改善肝纤维化大鼠血清指标及肝组织αSMA、I型胶原含量

检查血清ALT和AST以指示肝损伤（图3B）。与对照组相比，CCl₄组ALT、AST明显升高（P < 0.01），提示肝损伤严重。YYHXD治疗后血清ALT、AST较模型组明显降低（P < 0.01）。秋水仙碱治疗后，血清AST较模型组显著降低（P < 0.01），ALT无明显变化。YYHXD血清ALT、AST水平明显低于秋水仙碱组（P < 0.01）。

为了评估炎症，研究者检查了IL-6和TNF-α的水平（图3B）。与对照组相比，CCl ₄组显著上调IL-6和TNF-α。YYHXD和秋水仙碱均能显著抑制上述上调作用（P < 0.01）。YYHXD组IL-6、TNF-α水平明显低于秋水仙碱组（P < 0.01）。

为了进一步评估YYHXD的抗纤维化作用，研究者测量血清HA和LN（图3B）。结果显示：与正常对照组相比，CCl ₄组大鼠血清HA、LN水平明显升高（P < 0.01），而与肝纤维化模型组相比，YYHXD组和阳性对照组大鼠血清HA、LN水平明显降低（P < 0.01）。

图 3 YYHXD对CCl₄大鼠组织学改变的影响

此外，免疫组化结果显示，CCl ₄组大鼠肝纤维化指标α-SMA和I型胶原表达较对照组明显增加（P < 0.01）。与CCl ₄模型相比，YYHXD和阳性对照均显著降低α-SMA和胶原I表达（P < 0.01），表明YYHXD减轻CCl ₄诱导的纤维化（图4A-4C）。

图4  (A)检测肝组织中α-SMA和I型胶原的表达，观察肝纤维化程度。（A,B）免疫组化显示α-SMA和I型胶原阳性定位及阳性表达率。与模型组比较，**P < 0.01。(C)显示肝组织中α-SMA和胶原I表达的蛋白质印迹图像。**与模型组比较P < 0.01

YYHXD改善肝纤维化大鼠氧化应激的实验研究

研究者测量了GSH、SOD和MDA以评估YYHXD抗氧化作用（图4A）。与正常组比较，模型组肝组织GSH、SOD含量显著降低，MDA含量显著升高（P < 0.01）。与模型组比较，YYHXD组能显著升高GSH、SOD水平、显著降低MDA水平（P < 0.01）。与模型组相比，秋水仙碱组能显著降低MDA含量（P < 0.01），而对GSH、SOD影响不大。总体而言，YYHXD能提高大鼠的抗氧化能力，对CCl ₄诱导的大鼠肝纤维化具有保护作用。

图5 (A)治疗组抗氧化水平YYHXD。GSH、SOD、MDA。（B,C）YYHXD能减轻CCl₄肝纤维化诱导的肝实质细胞凋亡，与模型组比较，**P < 0.01。TUNEL测定的结果示于图5B、5C中。与模型组比较，YYHXD组和秋水仙碱组细胞凋亡率明显降低，P < 0.0001.

YYHXD对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响

TUNEL检测结果见图5B、5C。正常对照组凋亡的肝实质细胞数量很少，而肝纤维化模型组肝组织中凋亡的肝细胞较多。正如预期的那样，YYHXD能减轻CCl₄诱导的肝实质细胞凋亡，在空白组和模型组的细胞凋亡率分别为（0.07±0.03）和（0.79±0.06），其抗肝细胞凋亡的能力优于秋水仙碱。YYHXD组（0.19 ±0.04）和秋水仙碱组（0.48±0.03）的肝细胞凋亡率明显降低（P < 0.01），YYHXD组明显强于秋水仙碱组（P < 0.01）。

YYHXD抑制肝纤维化大鼠PI 3 K-Akt信号通路的研究

本研究中，网络药理学研究和分子对接实验提示PI 3 KAkt信号通路是YYHXD治疗肝纤维化的潜在药理机制。因此，研究者进一步采用免疫组化和Western blot方法检测了YYHXD对P-PI 3 K、P-Akt 1、HSP 90、MYC、P53等关键基因表达的影响。Western blot和免疫组化结果显示（图6A-6D），与正常组相比，CCl ₄模型组P-PI 3 K、P-Akt 1、HSP 90、MYC、P53蛋白的表达上调（P < 0.01），而YYHXD和秋水仙碱均显著降低了这些蛋白的表达（P < 0.01）。此外，免疫组化检测结果显示，与秋水仙碱治疗组相比，YYHXD组P-PI 3 K、P-Akt 1、HSP 90、MYC、p53蛋白表达较少；通过Western blot分析发现，与秋水仙碱治疗者相比，YYHXD组中P-PI 3 K、HSP 90、p53蛋白表达较少，但P-Akt1 和 MYC 蛋白的表达量却没有减少（P < 0.05）（图6E、6F）。

图6  PI 3 K-AKT信号通路和分子对接。（A，C）显示P-PI 3 K、P-AKT 1、HSP 90、MYC、P53的免疫组织化学图像。肝组织蛋白质阳性定位。（B、D）免疫组化阳性表达率。表达率。与模型组比较，**P < 0.01。（E，F）显示肝组织中P-PI 3 K、P-AKT 1、HSP 90、MYC、P53表达的蛋白质印迹图像。与模型组比较，**P < 0.01。

结论

YYHXD抗肝纤维化的机制涉及多成分、多靶点和多信号通路。PI3K/Akt通路可能是YYHXD抗肝纤维化的重要药理机制，研究者将网络药理学预测和实验验证相结合的综合方法，突出了YYHXD通过靶向PI3K/Akt信号通路治疗肝纤维化的临床潜力。

参考文献：

Bai YM, Liang S, Zhou B. Yangyinghuoxue decoction exerts a treatment effect on hepatic fibrosis by PI3K/AKT pathway in rat model: based on the network pharmacology and molecular docking. Aging (Albany NY). 2024 Feb 15;16(4):3773-3789. doi: 10.18632/aging.205559. Epub 2024 Feb 15. PMID: 38364259; PMCID: PMC10929827.