论著：| 环状RNA hsa_circ_0001573对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制研究

第一作者：陈 红（ORCID：0009-0002-7716-9587），硕士研究生在读。

通信作者：陈俊霞（ORCID：0000-0002-8531-7562），博士，教授，博士研究生导师。

乳腺癌是女性中发病率第一的恶性肿瘤， 2022年癌症统计数据显示，在美国乳腺癌已经占女性所有肿瘤的31%，并且呈年轻化趋势［1］。尽管出现了新的治疗途径，肿瘤复发仍然是乳腺癌治疗中的挑战。与乳腺癌发生、发展密切相关的新的分子生物标志物，将为乳腺癌诊治提供新的手段［2］。

与线性RNA结构不同，环状RNA（circular RNA，circRNA）呈单链共价闭合环状结构，无5'帽端和3'尾端［3］。在过去的30年里，这些circRNA被认为是错误剪接或前体mRNA加工过程中的副产物，在不同的生物体中，也只有少量circRNA被发现［4］。然而，随着高通量测序技术的发展和广泛应用，大量circRNA已被成功识别，研究［5］表明circRNA广泛参与细胞的生长、分化、发育和凋亡等病理生理学过程，并与多种恶性肿瘤的发生、进展相关。Wang等［6］研究表明，circRNA-000911在乳腺癌中通过对miR-449的海绵样作用，从而激活Notch1和核因子κB （nuclear factor κB，NF-κB）信号转导通路，发挥其抑制肿瘤的作用。研究［7］报道circ-0068631可通过与EIF4A3结合维持c-myc的稳定性，抑制circ-0068631/EIF4A3/c-myc轴是乳腺癌的一种潜在策略。机制研究［8］表明，USF2介导的circACTN4可能直接与FUBP1结合，二者之间的相互作用可以阻碍FUBP1与FIR的结合，从而激活c-myc的转录，circACTN4可能是一种新的预后生物标志物和有前景的乳腺癌治疗靶点。

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚单位β4（guanine nucleotide binding protein subunit beta 4，GNB4）

的异常表达影响多种实体肿瘤的发生、发展，如在乳腺癌中参与调控增殖、周期和凋亡［9］。c-myc在控制癌细胞增殖，凋亡及耐药性方面发挥着重要作用［10］。

本研究旨在探讨hsa_circ_0001573在乳腺癌中的表达及其促进乳腺癌增殖、侵袭及凋亡的作用，并初步探索hsa_circ_0001573与GNB4的相互作用机制，为寻找乳腺癌治疗新靶点提供线索。

1.1.1  临床样本和细胞系

选取重庆医科大学附属第一医院2020年1月—2021年1月经手术切除的女性乳腺癌患者40例标本，术前均签署知情同意书。标本切除后立刻保存于液氮中。本研究已获得重庆医科大学伦理委员会的批准。人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞系MCF-7和SK-BR-3保存于本实验研究中心。

1.1.2  主要试剂及实验动物

hsa_circ_0001573对照质粒和干扰质粒及其探针（Cy3标记）由广州吉赛生物科技股份有限公司设计合成。DMEM培养基和RPMI-1640培养基购自美国Saimike公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自重庆睿宸生物科技有限公司，转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和SYBR Green购自日本TaKaRa公司，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自美国Genview公司，TUNEL、EdU和Hoechst33342试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，transwell小室购自美国Millipore公司，CCND2、CCND1、CDK4、Bcl-2、bax、caspase-3（cleaved）和GAPDH抗体购自英国Abcam公司，4周龄BALB/c雌性裸鼠购自重庆腾鑫生物科技有限公司。

1.2.1  RNA微阵列芯片分析

提取4例未接受放化疗的女性乳腺癌患者术后乳腺癌组织和癌旁组织总RNA，检测浓度、纯度和完整度，检验合格后进行后续实验。上海康成生物科技有限公司对所提供的临床样本进行芯片测序，得到差异倍数＞2、P ＜0.05差异表达的circRNA差异表达谱，其中hsa_circ_0001573差异表达显著。

1.2.2  细胞培养与转染

正常人乳腺上皮细胞系（MCF-10A）以及乳腺癌细胞系（MCF-7和SK-BR-3）均使用含10%FBS的DMEM培养基，3种细胞系均在37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养，每隔12~24 h更新培养基。待显微镜下观察细胞密度达70%~80%时使用LipofectamineTM2000按说明书分别将质粒si-NC和si-circ转染至MCF-7细胞或SK-BR-3细胞中，24~48 h后收集细胞。

1.2.3  实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

转染24 h后，TRIzol法提取正常人乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）、乳腺癌组织和癌旁组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整度，酶标仪检测其纯度和浓度，在37℃ 15 min、85℃ 5 s的条件下将反应体系反转录为cDNA。hsa_circ_0001573在乳腺癌细胞和组织中的相对表达量由Bio-Rad公司的RTFQ-PCR仪检测。以cDNA为模板，GAPDH为内参，在95℃预变性3  min、95℃变性5 s、60℃退火3 s、72℃延伸3 s，共42个循环。每个样品设3个重复组，用2-ΔΔCt法计算hsa_circ_0001573的相对表达量。引物GAPDH上游引物序列为5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，下游引物序列为5'-AGCCTTCTCCATGGTGG TGAAGAC-3'；hsa_circ_0001573上游引物序列为5'-CACATGCTGGTGCACTCTGG-3'，下游序列为5'-ACACAGTCGGAGCAACCTGTG-3'；C-myc上游序列为5'-CGACGAGACCTTCATCAAA AA-3'，下游引物序列为5'-CTTCTCTGAGACGA GCTTGG-3'。

1.2.4  FISH检测hsa_circ_0001573的表达 

用PBS洗5 min（3次），用组织固定液（含DEPC水）固定15 min，TritonX-100（0.3%）冰上通透15 min；加入适量预杂交液使细胞完全覆盖，于37℃条件下温育1 h；混合hsa_ circ_0001573探针和杂交液（1∶99），于85℃变性5 min，37℃平衡2 min，滴加变性探针混合液使细胞完全覆盖，于37℃条件下杂交过夜；去除多余液体，2×SSC清洗5 min（6次），避光条件下滴加DAPI染色液复染15 min，PBS清洗5 min（3次）；封片后荧光显微镜下观察及拍照。1.2.5  伤口愈合实验检测细胞迁移    

细胞转染24 h后，待细胞生长密度达90%时用200 μL枪头进行划痕，采集0 h显微镜下划痕距离照片，使用无血清培养基培养24 h后采集24 h显微镜下划痕距离照片，通过计算出的迁移率表示细胞迁移能力。

1.2.6  Transwell实验检测细胞迁移与侵袭

将50 μL基质胶稀释液（基质胶与无血清培养基之比为1∶9）铺于transwell小室上室，4℃过夜备用于侵袭实验。用无血清培养基将转染 24 h后的乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）分别制成细胞悬液（2×104/mL），每孔200 μL接种至上室，下室加入500 μL含10%FBS DMEM的培养基，培养24 h后，弃去培养基后用棉签轻轻拭去下室表面的基质胶，甲醇固定30 min，PBS清洗5 min（3次），0.2%结晶紫染色15 min，晾干小室后显微镜下观察并拍照。迁移实验除不用铺基质胶外其余步骤都相同。

1.2.7  CCK-8和EdU实验检测细胞增殖 

将转染48 h后的乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）分别制成细胞悬液（1×104/mL）接种至96孔板中，贴壁4 h后每孔加入200 μL已按比例稀释的CCK-8溶液，放入温度37℃、CO2体积分数为5%的温箱中温育1 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度（D）值，连续记录0、24、48、72和96 h的数据并绘制生长曲线。待乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）在24孔板中贴壁后按照EdU操作说明书进行清洗、通透、Apollo染色及DAPI染色，然后荧光显微镜下观察并拍照。 

1.2.8  克隆形成实验

将转染24 h后的乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）分别制成细胞悬液（1×104个/mL），每孔100 μL接种于6孔板中，于37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。5 d后半量换液，10 d后弃去培养基，PBS清洗5 min（3次），用4%多聚甲醛固定20 min，0.2%结晶紫染色15 min，PBS清洗5 min（3次），晾干后拍照并进行计数。 

1.2.9  Hoechst33342实验检测细胞凋亡

将转染24 h后的乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）分别制成细胞悬液接种于铺有玻片的24孔板中，贴壁4 h后PBS清洗5 min，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染色20 min，PBS清洗5 min（3次），Triton X-100（0.5%）通透15 min，PBS清洗5 min（3次）；滴加Hoechst33342染色液至细胞完全覆盖，于37℃温箱中避光温育1 h；封片后荧光显微镜下观察及拍照。  

1.2.10  TUNEL法检测细胞凋亡 

将转染24 h后的乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）分别制成细胞悬液接种于铺有玻片的24孔板中，温育过夜，PBS清洗5 min（3次），4%多聚甲醛固定30 min，TritonX-100（0.5%）冰上通透10 min，PBS清洗5 min；每孔加入100 μL TUNEL检测液，于42℃温箱中避光温育1 h，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察及拍照。 

1.2.11  流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期

将乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3）分别接种至6孔板中，细胞转染72 h后用0.25%胰酶消化并收集于15 mL离心管中，PBS缓冲液10 000 r/ min离心5 min，弃上清液，重复2次。将1×106个细胞重悬于500 μL PBS中，AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞凋亡；将1×106个细胞重悬于100 μL PBS中，缓慢加入900 μL预冷75%乙醇（4℃条件下可保存2~3周），用流式细胞术检测细胞周期分布。

1.2.12  蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白水平

收集转染48 h后的各组细胞，提取总蛋白并测定浓度后按1∶4的比例将蛋白上样缓冲液（5×）加入到蛋白样品中，100℃金属浴10 min使蛋白变性备用，冷却后置于-80℃保存。每孔按10 μg进行上样，经10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulphate，SDS）-聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）恒压80 V电泳分离30 min、120 V分离40 min；冰水浴恒流240 mA转膜；脱色摇床上用10%脱脂奶粉封闭2  h；4℃摇床温育一抗（鼠抗caspase-3抗体1∶2  000，鼠抗Bcl-2抗体1∶1 000，鼠抗bax抗体1∶2 000，兔抗GAPDH抗体1∶5 000，兔抗CCND2抗体1∶2 500，兔抗CCND1抗体1∶2 000，兔抗CDK4抗体1∶2 000，兔抗GNB4抗体1∶1  500）过夜；37℃温育（二抗羊抗兔抗体1∶5 000，羊抗鼠抗体1∶5 000）1.5 h。采用ECL化学发光显色，在Bio-Rad凝胶成像仪中拍照，并用Image Lab对图像进行分析。

1.2.13  pull down实验

依次用0.1 mmol/L氢氧化钠、50 mmol/L氯化钠和20 mmol/L Tris对磁珠进行预处理。收集到的细胞经PBS清洗后加入裂解液进行裂解。加入生物素标记的hsa_circ_0001573探针重悬磁珠，在4℃摇床温育30 min后收集磁珠。加入450 μL 1×RNA Capture缓冲液后将Eppendorf试管置于磁力架重悬磁珠；再加入450 μL细胞裂解液，4℃摇床温育3  h，收集磁珠。用1×RNA Wash缓冲液涡旋清洗磁珠3次（5 s/次）。取100 μL 1×RNA Capture缓冲液和10 μL 5×Loading缓冲液重悬样品。100℃金属浴10 min，于-20℃保存。所得产物采用Western blot和质谱法检测。

1.2.14  细胞免疫荧光实验

将培养至对数生长期的各组细胞取出，PBS清洗5 min，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3 min（3次），Triton X-100（0.5%）冰上通透20 min，PBS清洗3 min（3次）；滴加3%牛血清白蛋白溶液（albumin, bovine standard solution， BSA），37℃温箱中封闭30  min，弃封闭液；加入3%BSA稀释后的一抗（GNB4，1∶100）， 4℃过夜；PBS清洗5 min（3次），在避光环境下加入荧光二抗（1∶100），37℃条件下温育30 min，PBS清洗5 min（3次）；加入DAPI染色液避光染色15  min，封片后荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.15  免疫组织化学检测

石蜡切片放置于65℃烤箱中烘烤2 h，二甲苯中浸泡15 min（2次），依次浸泡于乙醇中（100%、100%、95%、85%和75%）5  min，双蒸水中浸泡5 min（2次），PBS清洗5 min（3次）；切片置于90℃左右的枸橼酸钠缓冲液中加热20 min，冷却后PBS清洗5 min（3次）；弃去多余液体，加入阻断剂后避光温育10 min，PBS清洗5 min（3次）；滴加封闭液于室温封闭20 min；弃去多余液体，温育一抗（兔抗CCND2抗体1∶50，兔抗CCND1抗体1∶100，兔抗CDK4抗体1∶100）过夜；PBS清洗5 min （3次），滴加二抗（生物素标记），于37℃条件下温育20 min；滴加链霉卵白素工作液，于 37℃条件下温育20 min，PBS清洗3 min（3次）；滴加DAB显色液于切片上室温温育5 min，三蒸水洗；滴加苏木精染色液至切片上室温温育2 min，三蒸水洗；用1%盐酸乙醇分化切片，三蒸水洗；依次浸泡于乙醇中（70%、80%、95%、95%和100%）5 min，二甲苯中浸泡5 min（2次）；中性树胶封片，显微镜下观察及拍照。

1.2.16  裸鼠移植瘤实验

MCF-7细胞转染hsa_circ_0001573干扰质粒（si-circ）和对照质粒（si-NC），每间隔3 d更换新鲜培养基（含嘌呤霉素浓度为700 ng/ mL），培养两周后获得稳定转染细胞株；分别将两组稳转株制成细胞悬液（2×106个/mL），每只 100 μL接种于21~28 d龄的BALB/c裸鼠皮下（4只/组）；持续关注移植瘤生长情况，5周后处死小鼠取下移植瘤，制成石蜡切片用于免疫组织化学检测。

图1  乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达的circRNA热图

Fig. 1 Heat map of differentially expressed circRNA in breast cancer tissues and para-cancerous tissues

图2  hsa_circ_0001573的表达及定位

Fig. 2 Expression and localization of hsa_circ_0001573

A: Relative expression of hsa_circ_0001573 in cell lines; ***: P＜0.001, compared with MCF-10A; B: Relative expression of hsa_circ_0001573 in 40 cases of breast cancer tissues; *: P＜0.05, compared with paracancerous tissues; C: FISH detection (×400).

图3  RTFQ-PCR检测干扰质粒效率

Fig. 3 The transfection efficiency of breast cancer cells

***: P＜0.001, compared with si-NC

图4  下调hsa_circ_0001573对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

Fig. 4 Effects of downregulation of hsa_circ_0001573 on the migration and invasion of breast cancer cells

A: Wound healing (×50); B, C: Cell invasion (×200); D, E: Cell migration (×200); ***: P＜0.001, compared with si-NC.

图5  下调hsa_circ_0001573对乳腺癌细胞增殖能力的影响

Fig. 5 Effects of downregulation of hsa_circ_0001573 on the proliferation of breast cancer cells A, B: CCK-8; C-E: EdU (×100); F, G: Colony formation; ***: P＜0.001, compared with si-NC.

图6  下调hsa_circ_0001573诱导乳腺癌细胞凋亡

Fig. 6 Effects of downregulation of hsa_circ_0001573 on the apoptosis of breast cancer cells

A: Hoechst33342(×200); B: TUNEL (×100); C, D: Flow cytometry; E-G: Western blot; ***: P＜0.001, compared with si-NC; **:P＜0.01, compared with si-NC; *:P＜0.05, compared with si-NC.

图7  下调hsa_circ_0001573对乳腺癌细胞周期的影响

Fig. 7 Effects of downregulation of hsa_circ_0001573 on the cell cycle of breast cancer cells

A, B: Flow cytometry; C, D: Western blot; ***:P＜0.001, compared with si-NC; **:P＜0.01, compared with si-NC.

图8  敲低hsa_circ_0001573抑制移植瘤生长

Fig. 8 The growth of xenograft tumors was inhibited by silencing hsa_circ_0001573 

A: Xenograft tumors; B: Tumor weight; C: Growth curves of the xenograft tumors; D: Immunohistochemistry (×400); ***: P＜0.001, compared with si-NC; **:P＜0.01, compared with si-NC.

图9  hsa_circ_0001573与GNB4相互作用增强c-myc的表达

Fig. 9 Expression of c-myc was enhanced by the interaction of hsa_circ_0001573 with GNB4

A: RNA pull down; B: FISH-IF (×400); C: The efficiency after transfection with overexpressed GNB4 plasmid or sh-GNB4; D: Relative expression of c-myc after transfection with overexpressed GNB4 plasmid or sh-GNB4; E, F: Western blot; ***:P＜0.001, compared with mock or sh-NC; **: P＜0.01, compared with mock or sh-NC.

乳腺癌是全世界女性人口发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［2］。随着全球预期寿命的增加，乳腺癌的发病率和病死率可能会继续上升［11］。

CircRNA是一类共价闭环结构的非编码RNA，是由前体信使mRNA环化形成，多数存在于细胞质［12］。具有分布广泛、风度高和组织特异性强等特征，研究［13］表明，circRNA参与肺癌、肝癌及乳腺癌等多种肿瘤的发生与发展。CircRNA可与不同RNA结合的蛋白相互作用形成特定的RNA-蛋白质复合体，从而影响相关蛋白质的作用方式并促使肿瘤发生［14-15］。因此，研究异常表达的circRNA对乳腺癌进展影响的作用机制，为临床诊断、治疗新靶点及预后等提供理论依据依据具有重要意义。

本研究通过RNA微阵列芯片分析对4例乳腺癌组织和癌旁组织进行circRNA差异分析，发现hsa_circ_0001573在乳腺癌组织和细胞中差异表达最为明显，并采用RTFQ-PCR检测hsa_circ_0001573在35例乳腺癌组织和癌旁组织、正常人乳腺上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌细胞系（MCF-7和SK-BR-3）中的相对表达量，结果显示，hsa_circ_0001573在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中显著上调。此外，我们构建hsa_circ_0001573干扰质粒后转染至乳腺癌细胞中，通过一些列体外实验发现，敲低hsa_ circ_0001573后能显著抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。细胞周期蛋白D2（CCND2、CCND1）是两种重要的细胞周期调节因子，也是细胞周期蛋白D-CDK4复合物的关键成员，因此在多种癌症的发病机制中具有极其重要的意义［16］。Western blot和免疫组织化学检测结果显示，敲低hsa_circ_0001573后CCND2、CCND1和CDK4蛋白表达水平均显著下降，表明hsa_circ_0001573可通过影响细胞周期相关蛋白的表达，影响乳腺癌的发生、发展进程。研究［9］表明，GNB4的过度表达显著上调胃癌细胞中c-myc的表达水平，促进胃癌细胞的增殖和转移。本研究发现，GNB4可与hsa_circ_0001573相互作用增强c-myc的表达。

综上所述，本研究发现hsa_circ_0001573在乳腺癌组织和细胞中显著上调，敲低hsa_ circ_0001573后能抑制细胞增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡，hsa_circ_0001573能与GNB4相互作用增强c-myc的表达，说明其与乳腺癌的发生、发展有着密不可分的关系，有望成为乳腺癌治疗新靶标。但hsa_circ_0001573调控乳腺癌发生、发展的分子机制仍需深入研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。