Nature Methods：解码RNA与蛋白质相互作用的新视角：TREX技术的突破

引言

在现代生物学研究中，RNA分子与RNA结合蛋白（RBPs）的相互作用是调控基因表达的重要机制之一。这些相互作用影响着RNA的加工、运输、稳定性及其功能，进而控制着细胞的命运和生理状态。随着科学技术的发展，研究者们逐渐揭示了RNA与蛋白质之间复杂的互作网络，为理解生命过程中的精细调控提供了新的视角。

RNA分子在细胞中扮演着多种角色，从编码蛋白质的信使RNA（mRNA）到不编码蛋白质但在基因表达调控中起关键作用的非编码RNA（如转运RNA、核糖体RNA和长非编码RNA等）。RNA结合蛋白（RBPs）是一类能够特异性结合到RNA分子上，影响其功能和命运的蛋白质。通过与不同的RNA分子相互作用，RBPs参与了RNA的加工、编辑、运输和降解等过程，是RNA生物学中的关键因素。

2月19日发表于Nature Methods的研究“TREX reveals proteins that bind to specific RNA regions in living cells”，报道了一种名为TREX的技术。TREX（Targeted RNase H-mediated Extraction）技术，作为一种创新的实验方法，为研究活细胞中特定RNA区域与RNA结合蛋白之间的互作提供了强有力的工具。与传统的RNA蛋白质相互作用分析方法相比，TREX技术能够更加精确地识别出与特定RNA区域直接相互作用的蛋白质，无论这些相互作用发生在细胞的哪个部位，都能被有效捕获和鉴定。通过利用RNase H酶特异性地降解与DNA探针杂交的RNA区域，TREX技术不仅可以揭示已知的RNA-蛋白质相互作用，还能发现新的、未被发现的相互作用，为我们理解RNA在细胞中的功能和调控机制提供了新的可能性。

TREX（Targeted RNase H-mediated Extraction）技术，是一种创新的生物技术，旨在精确识别和分析活细胞中特定RNA区域与RNA结合蛋白（RBPs）之间的相互作用。该技术通过利用RNase H酶的特异性降解能力，配合定制的DNA探针精准靶向RNA序列，实现对特定RNA区域结合蛋白的有效提取和鉴定。此过程中，DNA探针与目标RNA形成DNA/RNA杂交复合体，RNase H酶识别这些复合体并特异性降解RNA链，从而释放与RNA直接相互作用的蛋白质，以供后续的质谱分析。

TREX与现有技术的比较

与传统的RNA-蛋白质相互作用分析技术相比，如RIP（RNA免疫沉淀）和CLIP（交联免疫沉淀）等，TREX技术在几个关键方面展现出显著优势：

特异性高：TREX技术通过特定的DNA探针直接靶向RNA序列，避免了非特异性背景的干扰，提高了实验的特异性和准确性。

灵敏度高：利用RNase H酶的高效率降解机制，TREX能够从大量非特异性蛋白中准确地提取出少量的特定RNA结合蛋白，显著提高了检测的灵敏度。

操作简便：相较于需要复杂交联和免疫沉淀步骤的传统方法，TREX技术流程简洁，操作便捷，大大降低了实验的操作难度和时间成本。

TREX在U1 snRNA和NORAD长非编码RNA上的应用

TREX技术已成功应用于多个关键的生物学研究中，其中包括对U1 snRNA和NORAD长非编码RNA（lncRNA）的结合蛋白进行的深入分析。

U1 snRNA：通过TREX技术，研究人员能够精确识别出与U1 snRNA特定区域相互作用的多个RNA结合蛋白，这些发现为理解U1 snRNA在剪接体组装和剪接调控中的作用提供了新的线索。

NORAD lncRNA：利用TREX技术，研究人员揭示了NORAD lncRNA与其结合蛋白之间的复杂互作网络，这对于探究NORAD在维持基因组稳定性中的功能具有重要意义。

TREX技术揭示的RNA与蛋白质的相互作用

45S rRNA的区域性互作组织图谱

TREX技术在揭示45S rRNA与RNA结合蛋白（RBPs）之间相互作用的研究中，展现出了前所未有的精确度和深度。通过精细的区域性分析，研究人员成功构建了45S rRNA的区域性互作组织图谱，这一成就不仅加深了我们对rRNA加工和成熟过程中蛋白质参与的理解，也为研究rRNA在疾病中的角色提供了重要的基础数据。

首次明确区分了与45S rRNA各个区域特异性结合的RBPs，揭示了复杂的蛋白质-RNA相互作用网络。通过对特定区域RBPs的功能分析，进一步阐释了这些蛋白质在rRNA加工、成熟及其调控中的作用。

针对特定RNA区域的RBPs的鉴定

利用TREX技术，研究人员能够精确鉴定出与特定RNA区域结合的RBPs。这一能力对于理解RNA的功能和其在细胞中的作用至关重要，尤其是在研究那些具有复杂结构和多功能性的长非编码RNA（lncRNA）和前体mRNA时。

针对U1 snRNA和NORAD lncRNA的研究，通过TREX技术成功鉴定了多个未知的与特定RNA区域结合的RBPs，为进一步研究这些RNA分子的功能和机制提供了新的线索。这些RBPs的鉴定有助于揭示RNA分子在细胞中的精确调控机制，包括剪接调控、基因表达调控等关键生物过程。

TREX在不同细胞类型中的应用潜力

TREX技术不仅在基础科学研究中具有广泛的应用前景，其在临床研究和疾病诊断中的应用潜力同样值得期待。通过在不同细胞类型中应用TREX技术，可以揭示特定疾病状态下RNA与蛋白质相互作用的变化，为疾病的早期诊断和治疗提供新的策略。

在肿瘤细胞中的应用可揭示与癌症进展相关的特定RNA与RBPs的相互作用，为发现新的癌症生物标志物和治疗靶点提供可能。在神经系统疾病模型中的应用，有助于理解神经退行性疾病中RNA与蛋白质相互作用的变化，为疾病的机制研究和药物开发提供重要信息。

TREX用于揭示在活细胞中结合特定RNA序列的蛋白质（Credit: Nature Methods）

TREX技术的实验设计与操作流程

样本准备与UV-C交联

在进行TREX技术的实验之前，首先需要准备好样本。样本的准备过程包括细胞的培养、收集以及使用UV-C光进行交联。UV-C交联是一个关键步骤，它通过UV光照射使得RNA分子与结合的蛋白质之间形成稳定的共价键，从而保持它们的相互作用状态不被后续的实验操作破坏。

细胞培养至适宜密度，以确保足够的样本量。使用冰冷的PBS洗涤细胞，移除培养基中的杂质。在冰上使用UV-C光照射细胞，光照强度和时间需要根据细胞类型和实验设计进行调整。

使用TREX技术进行RNA-蛋白质复合物的提取与鉴定

交联后的样本需要经过一系列的步骤来提取RNA-蛋白质复合物，并进行后续的鉴定。TREX技术的核心在于使用特异性的DNA探针和RNase H酶精确地剪切目标RNA，从而释放出与其结合的蛋白质。

将交联的样本用裂解液处理，释放细胞内的RNA-蛋白质复合物。添加特异性的DNA探针，这些探针能够与目标RNA特异性杂交。加入RNase H酶，特异性地剪切探针杂交的RNA区域，释放结合的蛋白质。通过质谱等技术对释放的蛋白质进行鉴定，确定与目标RNA相互作用的蛋白质。

数据分析与结果解释

通过TREX技术得到的数据需要进行详细的分析和解释，以确保实验结果的准确性和可靠性。数据分析主要包括蛋白质鉴定的结果分析、相互作用网络的构建以及功能注释。

使用专业的软件对质谱数据进行处理，识别出特定的蛋白质。根据蛋白质的鉴定结果，构建RNA与蛋白质之间的相互作用网络，分析这些相互作用在细胞中可能发挥的功能。结合生物信息学工具，对鉴定到的蛋白质进行功能注释，探索它们在生物学过程中的角色。

TREX技术面临的挑战与未来展望

技术限制与潜在的改进方向

尽管TREX技术为RNA与蛋白质相互作用的研究提供了一种强有力的工具，但其在应用过程中仍然面临一系列的技术挑战。首先，特异性DNA探针的设计与合成需要高度精确，以确保对目标RNA区域的特异性识别。此外，RNase H介导的RNA裂解过程需要严格的条件控制，以避免非特异性的RNA降解。针对这些技术难题，未来的研究可以探索更高效的探针设计算法，以及更为精细的酶反应条件优化，从而提升TREX技术的应用效率和数据准确性。

探针设计的优化：开发更高级的生物信息学工具，提高DNA探针的设计精度，减少非特异性结合。

酶反应条件的精细调控：通过实验参数的细致调整，优化RNase H的作用效率，减少背景噪音。

TREX在疾病机制研究中的应用前景

TREX技术在疾病机制研究中展现出巨大的应用潜力。通过精确鉴定疾病状态下的RNA-蛋白质相互作用变化，TREX技术不仅能够帮助研究人员深入理解疾病的分子机制，还能够为疾病的诊断和治疗提供新的靶点。例如，在肿瘤学研究中，通过分析肿瘤细胞特有的RNA-蛋白质相互作用，可能发现新的肿瘤生物标志物或治疗靶点。

疾病诊断：识别特定疾病状态下的独特RNA-蛋白质相互作用，开发新的诊断标志物。

靶向治疗：通过阻断异常的RNA-蛋白质相互作用，设计新型的靶向治疗策略。

结合TREX技术的创新应用

随着生物技术的不断进步，结合TREX技术的创新应用将不断涌现。例如，将TREX技术与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，可以实现对特定RNA-蛋白质相互作用的精确干预，进而探索其在细胞功能中的作用。此外，结合高通量测序技术，TREX技术可以用于全基因组范围内的RNA-蛋白质相互作用研究，极大地扩展了其研究范围和深度。

技术融合应用：探索TREX技术与其他前沿生物技术的结合应用，拓宽研究视野。

高通量分析：利用TREX技术进行大规模的RNA-蛋白质相互作用筛选，揭示细胞调控网络的全貌。

Q&A

TREX技术与传统的RNA互作分析技术有何不同？

TREX技术（目标RNA酶H介导的提取交联蛋白质）在精确性和特异性方面，与传统的RNA互作分析技术展现出显著的优势。不同于传统方法依赖于亲和纯化或质谱技术，TREX技术通过使用针对特定RNA区域设计的DNA探针，能够更精确地定位和鉴定与特定RNA结合的蛋白质。这种方法不仅提高了实验的特异性，还能够在活细胞中直接进行，保留了RNA-蛋白质相互作用的生理状态。

高特异性：通过特异性DNA探针定位特定RNA区域。

高精确性：直接在活细胞中进行，保持生理状态的真实性。

更广泛的应用范围：适用于各种细胞类型和生物样本。

TREX技术在疾病研究中的应用潜力如何？

TREX技术在疾病机制研究和早期诊断中展现出巨大的应用潜力。通过精确鉴定疾病相关的RNA-蛋白质相互作用，TREX技术不仅能揭示疾病发生的分子机制，还能为发现新的生物标志物和治疗靶点提供依据。特别是在癌症、神经退行性疾病等复杂疾病的研究中，TREX技术的应用能够帮助科研人员深入理解疾病的分子基础，指导临床治疗策略的制定。

揭示疾病分子机制：精确鉴定疾病状态下的RNA-蛋白质相互作用。

发现生物标志物和治疗靶点：为疾病诊断和治疗提供新思路。

TREX技术的操作难度和成本如何？

相较于传统的RNA互作分析技术，TREX技术在操作上要求更高的精确性和专业知识，特别是在设计针对特定RNA区域的DNA探针和进行RNase H介导的裂解过程中。然而，随着相关技术的不断成熟和优化，这些操作难度正在逐步降低。在成本方面，TREX技术相较于一些高端的质谱分析方法，在某些方面可能具有成本效益，尤其是在大规模筛选研究中。随着技术的普及和实验材料的标准化，预计未来TREX技术的操作难度和成本将进一步降低。

操作难度：需要专业知识和精确操作，但随技术优化逐渐降低。

成本效益：在大规模筛选研究中可能更具成本效益，且随技术普及和材料标准化成本将降低。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02181-1

Dodel M, Guiducci G, Dermit M, Krishnamurthy S, Alard EL, Capraro F, Rekad Z, Stojic L, Mardakheh FK. TREX reveals proteins that bind to specific RNA regions in living cells. Nat Methods. 2024 Feb 19. doi: 10.1038/s41592-024-02181-1. Epub ahead of print. PMID: 38374261.