Parasit Vectors：华支睾吸虫与乙肝病毒混合感染：临床肝脏指标及肝细胞模型中的相互作用

背景：华支睾吸虫成虫寄生在人的肝内胆管内，引起食源性寄生虫病华支睾吸虫病。据报道，全球约有1,500万人感染华支睾吸虫，主要集中在韩国、中国、越南北部和俄罗斯远东地区，其中约1,300万人在中国，特别是在广东省和广西壮族自治区中国南部。乙肝病毒(HBV)攻击肝脏细胞，导致乙肝的发生。世界卫生组织估计，2019年有2.96亿人患有慢性乙肝，每年新增感染150万人。大约15%-25%的慢性乙肝感染者死于肝硬变或肝细胞癌；2019年，估计有82万人死于与乙肝病毒相关的疾病，这是一个严重的公共卫生问题。中国属于中等流行区，乙肝表面抗原阳性率为6.89%。在中国，乙肝病毒感染者多见于中华绒毛虫病高发区。中华绒毛虫流行区的乙肝表面抗原阳性率明显高于非流行区。人们普遍认为，免疫功能障碍在持续的乙肝病毒感染、肝脏炎症和肝纤维化中起着重要作用。成虫可以在宿主体内触发2型或混合的1型/2型免疫反应。华支睾吸虫感染还可诱导FVB小鼠的CD4+淋巴细胞活化，包括辅助性T细胞1/2/17(Th1/Th2/Th17)和调节性T(Treg)细胞。在我们之前的研究中，我们发现中华绒毛虫和乙肝病毒混合感染的患者血清IL-6和IL-10水平较高，而血清干扰素-γ水平较低，提示联合感染可加剧Th1型/Th2型细胞因子的失衡。这些结果还表明，中华绒毛虫合并感染可能通过调节免疫反应，进而影响乙肝的进展和肝纤维化的发生。

目的：在目前的研究中，我们通过分析临床肝脏指标和使用细胞模型检测纤维化相关分子和细胞因子的水平，进一步研究了合并感染对肝纤维化的影响。此前，我们还发现，合并感染的患者表现出较弱的肝功能和较高的HBVDNA拷贝数。此外，联合应用抗病毒药物(恩替卡韦[ETV])和抗中华绒毛虫药物(吡喹酮[PZQ])有助于降低病毒载量，促进肝功能恢复。在本研究中，我们还分析了ETV和/或PZQ对细胞模型的影响，以证实上述影响。

方法：对72例华支睾吸虫感染者和29例健康体检者的临床资料进行分析。我们还用中华绒毛虫成虫总蛋白(CsTPs)和乙肝病毒阳性血清培养了肝星状细胞系LX-2。此外，用抗病毒药物ETV、CsTps和抗中华绒毛虫药物PZQ。

结果：血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TB)、透明质酸(HA)在合并感染组明显高于单纯感染组。在细胞模型中，与乙肝病毒阳性血清孵育的LX-2细胞模型(HBV组)相比，CsTP+HBV组LX-2细胞α-平滑肌肌动蛋白和I型、III型胶原的转录水平显著升高，而肿瘤坏死因子-α、白介素1β和IL-6的信使RNA水平明显降低。经ETV和CsTPS处理的HepG2.2.15细胞的乙肝表面抗原和HBe抗原水平高于ETV组和ETV、CsTPS和PZQ混合物处理的细胞。

图1 CCK-8比色法测定人肝星状细胞系LX-2的细胞增殖。用不同浓度的CsTps(A)、HBVdna阳性血清(B)或CsTps与HBVdna阳性血清的混合物(C)培养LX-2细胞24 h，并以磷酸盐缓冲液或0.5µg/mlBSA处理细胞作为对照。数据以平均值±标准误差(SE)表示。统计学处理采用单侧配对t检验，星号表示与对照组比较*P<0.001.0 5，*P<0.0 5；

图2定量聚合酶链式反应检测α-SMA(A)、I型胶原(B)和III型胶原(C)在LX-2细胞中的表达水平。用CsTps、乙肝病毒阳性血清或CsTps与乙肝病毒阳性血清的混合物(CsTP+HBV)刺激LX-2细胞。对照组LX-2细胞用乙肝病毒阴性血清、牛血清白蛋白或牛血清白蛋白与乙肝病毒阳性血清(BSA+乙肝病毒)混合处理。用Q-PCR方法从各组LX-2细胞总RNA中扩增出相关分子的转录产物。与β-肌动蛋白表达相关的基因水平正常化。数据以平均值±标准差表示。经单因素方差分析，各组间比较差异有统计学意义(P<0.001，P<0.01)。+P<0.001)

图3定量聚合酶链式反应检测LX-2细胞中肿瘤坏死因子-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)的表达水平。LX-2细胞与CsTps、乙肝病毒阳性血清或CsTps与乙肝病毒阳性血清的混合物(CsTP+HBV)孵育。用乙肝病毒阴性血清、PBS或BSA和乙肝病毒阳性血清的混合物(BSA+乙肝病毒)处理细胞作为对照。用Q-PCR方法从各组LX-2细胞总RNA中扩增出相关分子的转录产物。与β-肌动蛋白表达相关的基因水平正常化。数据以平均值±标准差表示。经单因素方差分析，差异有统计学意义(*P<0.001，**P<0.01，*与对照组比较；+P<0.001，++P<0.001)

图4 检测HepG2.2.15细胞培养上清液中的HBs-Ag、HBeAg和HBVDNA拷贝数。分别与ETV、CsTPS、ETV+CsTP、ETV+牛血清白蛋白(ETV+BSA)或ETV与CsTPS的混合物分别加入0.1、1、10μg/mlPZQ。采用电化学发光免疫分析法检测细胞培养上清液中HBs Ag(A)、HBeAg(B)水平，Q-PCR法检测HBVDNA拷贝数(C)。数据以平均值±标准差表示。经单因素方差分析，各组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。HBVe抗原；HBs抗原，乙肝表面抗原；ETV，恩替卡韦；PZQ，吡喹酮

结论：中华绒毛虫和乙肝病毒混合感染可加重肝纤维化的进展。CsTps可能促进了乙肝病毒感染者肝脏的慢性炎症，导致肝纤维化的发生。

原文出处：Dong H,  Zhao L,  Sun H,et al.Coinfection of Clonorchis sinensis and hepatitis B virus: clinical liver indices and interaction in hepatic cell models.Parasit Vectors 2022 Dec 12;15(1)