【衡道丨笔记】NGS检测原理

内容摘要

 一、NGS的发展与主流平台介绍

二代测序的应用领域

• 无创产前检测

• 遗传性肿瘤诊疗

• 肿瘤靶向诊疗

• 病原微生物检测

• 测序技术的迭代发展

二代测序技术主流平台

二代测序的常见术语

Reads数：

测序时每产生一条序列称为一个Read，一次测序完成后产生的所有序列总数即为Reads数。

测序读长：

测序时一次反应所读取的序列长度，如2x150 bp即表示双端各读取150bp长度的序列。DNA文库的插入片段长度必须在读长范围内。

测序通量：

一次测序所产生的数据总量，可理解为（Reads数x读长）。

测序深度：

目标基因组中特定核苷酸被测的次数，可理解为测序得到的数据总量与目标基因组大小的比值。

 一、NGS建库测序原理及实验流程

建库三大平台

1、扩增子平台

• 针对性强

• 可达成千上万重扩增反应同时进行

• 操作快速简便

2、杂交捕获平台

• 目标区域容量大，通用性强

• 可添加UID，灵敏度更高

• 满足ctDNA检测需求

• 检测流程长，考虑报告周期

流程：

预文库→杂交→捕获→洗涤→扩增捕获文库

3、HANDLE平台

• 极简操作，单管完成，<1h手工操作

• 可添加UID，特异性出众

• 多种变异类型同时检测

• 适合临床检测

流程：

主流平台测序原理

1、IlIumina平台测序原理：

碱基互补配对原则：

1、在DNA聚合酶的作用下连接一个带荧光的碱基

2、清除未反应的碱基和酶

3、激发荧光信号并读取

4、去除荧光基团和阻断基团

2、lon Torrent平台测序原理：

乳液PCR：做好的文库，种到测序珠子上进行扩增。

3、ADx-SEQ200Plus测序原理：

DNA纳米球→阵列式流动槽→联合探针锚定聚合技术

三、NGS基于HGVS的基因变异命名规范

• 所有变异类型的描述应该基于DNA水平上的改变，RNA或蛋白质水平的改变可以作为补充。

• 确认所描述的变异是实验所得还是理论推断所得，如果是理论推断所得要加括号。

• RNA或蛋白质水平的检测结果的描述不能用于反推DNA的改变(描述)，因为转录/翻译方式、简并密码子等问题。

• 使用公开且描述清晰的参考序列。

• 参考序列使用NCBI或EBI数据库中的ID，必须同时包含accession和version信息。

• 如果在NCBI和EBI中没有合适的参考序列，可申请一个LRG编号。

• 标记变异所在位置时使用参考序列的首字母缩写。

• 变异位置与参考序列文件标识符之间用“：”隔开，例如 NM 000059.3：exon23：c.9085G>A：p.(A3029T)。

• 基因组序列(前缀为9.)：位置1指第一个基因组第1个核苷酸(不可使用+、-或其他符号标志)。

• 编码DNA(前缀为c.)：位置1指启动密码子ATG中的第一个核苷酸A。

• RNA(前缀为r.)：与编码DNA类似。

• 蛋白质(前缀为p.)：位置1指蛋白质第一个氨基酸。

• 也适用于单碱基或随机串联重复(氨基酸和核苷酸)。

• 所有水平的描述均适用(genome，gene，transcript，protein)

• 特例：使用c.，r. or n.描述外显子/外显子连接区域的缺失/重复时不适用。

• DNA-level 123456A>T。

• RNA-level 76a>u。

• protein level Lys76Asn(三字母优先于单字母)。

• 国际生化联合命名委员会(NC-IUB)的命名规范。

• 当一个变异同时适用重复或插入的变异类型时，根据优先级应描述为重复。

• 缺失一部分序列不可再用一部分相同的序列替代。

• 间隔一个核苷酸的两个变异，如果影响同一个氨基酸，应描述为“delins”。

• 新版的规则将改为：两个变异被少于两个核苷酸隔开时应描述为“delins“。

NGS在临床中的应用

基于扩增子建库的Classic Panel：

适合院内落地的靶向用药NGS检测首选

• 一次性检测包括肺癌8个核心基因、NTRK1/2/3等在内的40个靶向用药基因。

• 涵盖肺癌、肠癌、胃癌、食管癌、甲状腺癌等20+癌种；涉及已获批或正在临床试验中的70+药物。

• 涵盖部分免疫治疗相关基因。

基于HANDLE建库的Classic Panel NGS产品：

简单快速，更易于院内开展