STTT 张卫东/刘霞/段大跃团队合作发现黄芪甲苷衍生物HHQ16改善梗死后心肌肥厚和心力衰竭的作用机制

心肌梗死（myocardial infarction, MI）后的心室重构是心力衰竭（heart failure, HF）最常见的病因。心肌细胞的丢失导致心脏负荷增加，引发神经体液级联反应和心肌重构，表现为心脏整体扩张和远端非梗死区域的心肌肥厚。大量临床研究表明，心衰药物治疗（ACE抑制剂、β-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、ANRIs、SGLT2拮抗剂等）或手术治疗（主动脉瓣置换术、心脏再同步化疗法和左心室辅助装置疗法）可以消退缺血性（MI后）或非缺血性HF患者的心肌肥厚，这一消退和心功能改善及预后有着明确的联系，接受HF治疗而心肌肥厚未消退的患者，生活质量更差，死亡率也更高。因此，靶向心肌肥厚消退是心室重构和HF的一种潜在治疗策略。然而，肥厚消退的分子机制仍有待阐明，目前还没有一种治疗能直接在心肌细胞水平逆转已经存在的细胞肥厚，这一领域的研究对心衰药物的研发具有重要意义。 

2023年10月19日，海军军医大学张卫东教授、刘霞教授及西南医科大学段大跃教授课题组合作在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了题为“Astragaloside IV derivative HHQ16 ameliorates infarction-induced hypertrophy and heart failure through degradation of lncRNA4012/9456”的研究。该研究发现新型小分子黄芪甲苷（Astragaloside IV）衍生物HHQ16通过与lnc4012/9456特异性结合导致其降解，进而拮抗G3BP2/NF-κB信号传导，直接作用于心肌细胞产生抗肥厚作用，有效逆转MI后的心室重构并改善心功能。

黄芪甲苷（Astragaloside IV）是心衰传统治疗中药黄芪的有效活性物质。科学证据表明，Astragaloside IV能显著逆转实验性慢性心衰模型的不良重构，但直接靶点和作用不明确。作者以Astragaloside IV为先导化合物，筛选出了新的小分子HHQ16（图1a）。在左前降支结扎（left anterior descending coronary artery ligation, LADL）诱导的MI后HF小鼠模型中，HHQ16可显著增加左室射血分数（ejection fraction, EF）和短轴缩短率（fractional shortening, FS），且呈剂量依赖性。10 mg/kg剂量的HHQ16与心衰的一线药物依那普利（2mg/kg）的效果相当，优于LCZ696（100mg/kg）（图1b-d）。同时，HHQ16可显著缩小MI诱导的肥厚心脏体积，降低心脏重量与体表面积之比（HW/BSA）。重要的是，HHQ16显著减少MI诱导的心肌细胞体积（大小），改善纤维化以及线粒体形态（图1e-h）。综上，证明HHQ16治疗可有效逆转MI诱导的小鼠心脏功能恶化和心肌重构。

RNA测序显示，受HHQ16影响的差异mRNA主要富集于肥厚标志物Anp、Bnp和β-Mhc，以及扩张型心肌病和肥厚型心肌病，表明HHQ16对心脏肥厚具有显著的调控作用。随后的研究结果表明，HHQ16治疗LADL诱导的小鼠或ISO诱导的心肌细胞的肥厚表型，包括细胞大小和肥厚标志物的转录和蛋白水平，均可恢复到正常水平，表明HHQ16直接作用于心肌细胞发挥抗肥厚作用。

图1. 新分子HHQ16显著改善HF小鼠的心功能并逆转心肌重构

LncRNA通过调控编码蛋白质的mRNA的表达，在生物过程中发挥着重要作用。测序分析发现ENSMUST00000219456（lnc9456）是受HHQ16调控最显著的lncRNA，它在肥厚和衰竭心脏中明显增加，并几乎被HHQ16完全抑制。进一步发现HHQ16能显著抑制ISO、Ang II或ISO+PE诱导的原代或HL-1心肌细胞中lnc9456的高表达。有趣的是，它在正常心脏中几乎无法被检测到，但在LADL诱导的肥厚和衰竭小鼠心脏以及ISO诱导的肥厚心肌细胞中高度表达，且与肥厚标记物（Anp和Bnp）表达趋势一致（图2a-b），提示lnc9456具有促肥厚作用。随后的研究发现，lnc9456在体外HL-1心肌细胞中过表达确实诱导了细胞大小和肥厚生物标志物的显著增加（图2c-e）。当敲低lnc9456时，ISO+PE诱导的心肌细胞肥厚的作用被消除（图2f-g），表明lnc9456在神经激素激活驱动的心肌细胞肥厚中起着关键作用。

图2. Lnc9456对心肌细胞肥厚至关重要

为探索lnc9456影响心肌细胞肥厚的下游机制，作者将catRAPID数据库预测功能与RNA pull-down实验相结合，鉴定出Ras GTP酶激活蛋白（SH3结构域）结合蛋白2（Ras-GTPase-activating protein (SH3 domain)-binding protein 2, G3BP2）与lnc9456可直接结合，并且只有当lnc9456过表达时才能检测到它们的结合（图3a-f）。先前的研究报道，G3BP2可以与IκBα结合，从而促进NF-κB p65核转位，启动肥厚基因转录并诱导心肌肥厚。但尚不清楚G3BP2与IκBα的结合在心肌肥厚发展过程中增加的原因和方式。在这里，作者证实了lnc9456过表达，即在病理应激下高水平的lnc9456，能够增强G3BP2与IκBα的结合，使得NF-κB p65核转位，从而促进心脏肥厚和诱发HF（图3g-h）。

图3. Lnc9456与G3BP2相互作用，促进NF-κB p65亚基的核转位

作者进一步探讨了HHQ16如何调节lnc9456的表达。HHQ16可显著降低心肌细胞中lnc9456的半衰期及腺病毒（AdV-lnc9456）诱导的lnc9456高表达（图4a-b），提示转录后调节。进而发现HHQ16仅在存在心肌细胞裂解物的情况下，以时间和剂量依赖的方式降低体外转录的lnc9456的水平（图4c-e）。微尺度热泳分析（Microscale thermophoresis, MST）结果进一步表明，HHQ16与lnc9456具有高亲和力，K_d为15.3 μM（图4f）。因此，HHQ16可以特异性靶向结合lnc9456，并促进其在心肌细胞中的降解。

图4. HHQ16以高亲和力直接与lnc9456结合并诱导其降解

作者进一步评估了lnc9456在体内心脏功能获得和丧失后对HHQ16活性的影响。首先，构建腺相关病毒（AAV-lnc9456）进行小鼠心脏原位注射，诱导心肌细胞特异性过表达lnc9456，注射4周后，连续给药HHQ16 2周。结果显示，与对照小鼠（AAV-Vector）相比，AAV-lnc9456小鼠显著增加了lnc9456在心脏中的表达，同时具有显著更低的EF和FS，更大的心脏大小、心脏重量和心肌细胞大小（图5a-e）。而HHQ16治疗可以降低心脏中lnc9456的高水平，并使心肌细胞特异性过表达lnc9456小鼠的心肌重构相关变化得到改善（图5a-e），进一步支持HHQ16通过lnc9456的转录后抑制发挥其作用。随后，进行了体内心脏心肌细胞特异性lnc9456功能丧失实验，与lnc9456^f/f（野生型）小鼠相比，在LADL后8周，lnc9456^CKO（心肌细胞特异性敲除等位基因）小鼠具有显著更高的EF和FS、更低的HW/BSA比率和小的心脏大小、心肌细胞大小，显示出lnc9456缺失在心脏功能和重构中的保护作用（图5f-j）。同时，HHQ16仅在lnc9456^f/f小鼠中表现出对肥厚和HF的抑制作用，而在lnc9456^CKO小鼠中没有表现出抑制作用，确定lnc9456是HHQ16逆转肥厚和HF特异性靶点（图5f-j）。

图5. Lnc9456是HHQ16逆转小鼠心肌肥厚和功能障碍的必要分子

最后，作者证实LOC107984012（lnc4012）是lnc9456的人类直系同源物，以及鼠lnc9456和人lnc4012之间分子机制的一致性，并且lnc4012/9456是HHQ16逆转病理性肥厚和HF的真正靶点。

综上所述，该研究提供了治疗心肌梗死后肥厚和心力衰竭的新分子HHQ16，全面表征了一种新发现的人类lncRNA（lnc4012）及其小鼠同源物（lnc9456），并对lnc4012/9456在MI诱导的肥厚和HF发展中的作用提供了新的机制见解。同时还提供了令人信服的证据，证明lnc4012/9456是一种新的小分子HHQ16的真正靶点，通过与lnc4012/9456特异性结合导致其降解，并拮抗其对G3BP2/NF-κB信号传导的作用，有效逆转梗死诱导的肥厚和HF（图6）。小分子靶向降解病理性增加的lnc4012/9456可能是一种新的有前途的肥厚消退策略，且可能不仅仅在MI诱导的心肌肥厚和HF发挥作用，未来可在非缺血性HF模型中继续进行探索和研究。

图6. HHQ16通过降解lncRNA4012/9456改善梗死诱发的肥厚和心力衰竭机制示意图

海军军医大学张卫东教授、刘霞教授及西南医科大学段大跃教授为该论文的共同通讯作者，海军军医大学万静静讲师、张圳博士为本论文的共同第一作者。该工作获得了国家中医药管理局创新团队与人才培养计划、国家自然科学基金、上海市科技创新行动计划和泸州市人民政府与西南医科大学科技战略合作项目的资助。

原文链接：

https://doi: 10.1038/s41392-023-01660-9