Circ Res 上海交通大学医学院附属瑞金医院张瑞岩/闫小响团队揭示血管平滑肌细胞NR4A3驱动动脉钙化的新机制

动脉中层钙化(Medial arterial calcification, MAC)是指在动脉中层出现钙磷酸盐积聚并形成羟基磷灰石晶体。MAC通常随着年龄增长在多种代谢性疾病中观察到，如慢性肾脏疾病(CKD)和糖尿病等，与动脉硬度增加、舒张期心力衰竭和高血流器官灌注受损密切相关。MAC的发展是通过复杂的细胞内机制介导的，包括钙磷稳态失衡、表观遗传途径激活、成骨细胞特异性转录因子的激活以及氧化DNA诱导损伤等。血管平滑肌细胞(VSMCs)是动脉中层的主要细胞。VSMCs的表型转换，即从收缩样表型转换为成骨样表型，是导致血管钙化的关键事件。因此，深入理解VSMCs的表型转换机制对于开发针对性的动脉中层钙化治疗手段具有重要意义。

NR4A3(也称为NOR-1)与NR4A1和NR4A2是组成NR4A孤儿核受体亚家族的转录因子，既往被报道作为即刻-早期反应基因调控细胞对外界刺激的反应，参与细胞增殖、分化、凋亡等重要生物学过程。已有证据表明，NR4A受体在成骨细胞中调节成骨基因的表达和分化，且NR4A3缺乏会减少VSMCs的增殖和迁移。因此，NR4A3可能在VSMCs表型转换和动脉中层钙化中发挥重要作用。

2024年4月17日，上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏内科张瑞岩/闫小响教授团队在Circulation Research杂志在线发表了题为“Orphan Nuclear Receptor NR4A3 Promotes Vascular Calcification via Histone Lactylation”的研究论文。本研究首次揭示血管平滑肌细胞NR4A3在动脉中层钙化中的重要作用，发现NR4A3介导的糖酵解增强和乳酸增多促进Phospho1启动子区域组蛋白H3K18位点的乳酰化修饰，最终促进了动脉钙化的发生。本文揭示的NR4A3介导的代谢组-表观基因组信号级联可能为预防动脉中层钙化提供新的见解。

首先，研究者在两种小鼠模型包括1,25(OH)₂VitD₃诱导的动脉钙化模型以及腺嘌呤联合高磷饮食诱导的CKD相关动脉钙化模型中发现，钙化血管中血管平滑肌细胞NR4A3表达增加，临床患者样本和体外细胞实验也证实这一结果。

为了探究NR4A3在动脉钙化中的生物学作用，研究者构建了NR4A3敲除 (NR4A3^-/-)小鼠，在上述两个小鼠钙化模型中进行检测。实验结果表明，NR4A3敲除小鼠的血管钙化程度显著减轻，钙盐沉积减少，血管平滑肌成骨样表型转换被抑制。在体外β-GP诱导模型中，NR4A3敲除的血管平滑肌细胞也表现出钙盐沉积的减少。

研究者进一步探索了NR4A3促进动脉钙化的下游机制。鉴于NR4A家族作为控制葡萄糖摄取、糖酵解和糖原分解的关键转录调节因子，研究者首先研究了VSMCs中NR4A3表达相关的代谢活动，发现NR4A3促进VSMCs葡萄糖摄取和糖酵解过程，导致乳酸等糖酵解相关产物的增加。

为了探索NR4A3促进糖酵解的具体机制，研究者对RNA测序数据和NR4A3 CUT&Tag数据进行综合分析，结果提示 NR4A3直接结合糖酵解相关代谢酶ALDOA和PFKL的启动子区域。实验结果证实，NR4A3敲除显著降低钙化条件下血管平滑肌细胞中ALDOA和PFKL的表达。因此，在血管钙化中平滑肌细胞NR4A3表达增多，直接结合ALDOA和PFKL的启动子区域并促进其表达，从而提高细胞糖酵解速率，导致乳酸等产物增多。

乳酰化是一种近年来新发现的表观遗传修饰，它将代谢过程与基因调控相关联。研究者发现，在β-GP刺激下，血管平滑肌细胞的组蛋白乳酰化修饰显著增多，在小鼠样本和人类样本中，钙化区域可观察到显著升高的乳酰化修饰信号。应用3PO和2DG等糖酵解抑制剂，研究者证实β-GP刺激下乳酰化修饰的升高依赖于糖酵解过程。

为检测乳酰化修饰在血管钙化中的作用，研究者在两种小鼠模型和体外细胞模型中分别给予外源性乳酸或者乳酸脱氢酶(LDHA)抑制剂FX-11，结果证明乳酸可以直接促进血管钙化和钙盐沉积，而FX-11减轻血管钙化水平。P300被认为是组蛋白乳酰化修饰的主要“Writer”，进一步实验证明，在β-GP诱导模型中敲减P300降低H3K18la水平，可减少乳酸钠诱导的钙沉积，而不影响细胞内乳酸水平。因此，研究者发现增强的组蛋白乳酰化促进血管钙化。

研究者进一步检测了NR4A3与乳酰化修饰的关系，结果表明，NR4A3敲除降低CKD造模后钙化动脉中平滑肌细胞乳酰化修饰水平的升高。同样，在β-GP刺激下，NR4A3敲除显著降低组蛋白H3K18位点的乳酰化修饰水平。以上结果表明，NR4A3通过促进糖酵解和乳酸生成，提高乳酰化修饰水平，从而加重动脉钙化。

最后，研究者深入研究了NR4A3介导的组蛋白乳酰化促进血管钙化的机制。综合分析H3K18la CUT&Tag和RNA测序数据，研究者发现Phospho1的启动子区域的H3K18la水平在NR4A3敲除后显著降低。实验结果证实，Phospho1的表达水平在添加外源性乳酸后升高，同时沉默P300后升高被逆转，说明其表达水平受到H3K18la的正向调控。NR4A3敲除在体内和体外模型中均下调Phospho1的表达，且Phospho1抑制剂MLS-0263839可显著降低NR4A3过表达所致的钙盐沉积增多。

综上所述，该研究发现在人类和小鼠血管钙化中，钙化区域平滑肌细胞NR4A3表达增加。NR4A3敲除可以在多种模型中抑制小鼠动脉钙化，减少钙盐沉积。在机制上，在VSMCs中，NR4A3通过直接结合糖酵解关键酶ALDOA和PFKL启动子促进其转录，从而增强糖酵解和乳酸生成。增多的乳酸促进Phospho1启动子区域组蛋白H3K18位点的乳酰化修饰，Phospho1表达升高，促进血管钙化进展。该研究揭示了血管钙化中全新的代谢组-表观基因组信号，为动脉钙化的防治提供了新的视角。

上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏内科马文琦、贾康妮、程豪迈为论文的共同第一作者，瑞金医院心脏内科张瑞岩教授和闫小响教授为论文的共同通讯作者。本研究获得国家自然科学基金等项目资助。

原文链接：

https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCRESAHA.123.323699