FRBM：急性缺血性中风合并糖尿病患者炎症反应紊乱，Resolvin D2治疗可挽救炎症反应

背景：糖尿病(DM)患者急性缺血性中风(AIS)患病率高，更容易患AIS，导致发病率和死亡率增加。炎症已被证明在糖尿病的病理生理学及其并发症中起着关键作用，包括AIS。在缺血缺血症动物模型中，研究表明，DM可激活小胶质细胞/巨噬细胞，增加促炎介质水平，并激活经典的促炎信号，如丝裂原活化蛋白激酶和核因子κ-B(NFκB)通路。这些由DM引发的促炎活动进一步诱导神经细胞死亡，加剧血脑屏障的破坏，导致更糟糕的结局。因此，更好地了解DM相关AIS的过度炎症机制，有利于开发新的治疗方法。

炎症消退的研究进展发现了一种程序化促消解作用的机制。与传统观点认为炎症的消退是在炎症刺激清除后被动诱导的相比，有证据表明炎症消退是一个主动的、程序化的过程，由所谓的特殊的促消解脂质介体(SPM)介导。这些SPM包括花生四烯酸(AA)衍生的脂氧素(LXs)、二十二碳四烯酸(DHA)衍生的分解蛋白(RVDS)、保护素(PDs)和松脂(MARS)以及二十碳五烯酸(EPA)衍生的分解蛋白(RvE)。在急性炎症的挑战下，脂氧合酶(LOXs)被激活，并促进其前体合成SPM。SPM通过与其受体结合，诱导促分解活性和对抗促炎过程，从而在促进炎症组织的动态平衡中发挥关键作用。

炎症分解功能障碍可能导致某些疾病的过度炎症，包括糖尿病和AIS。对肥胖小鼠模型的研究表明，脂肪组织中的SPM水平降低，而像RvD2这样的SPM的治疗通过调节脂肪因子的产生和单核细胞功能来抵消局部炎症。此外，RvD2还被证明能够减少饮食诱导的肥胖小鼠的肥胖和改善葡萄糖耐量，并挽救糖尿病小鼠有缺陷的血管重建。这些研究表明，分辨率和SPM在糖尿病相关疾病中起着关键作用。

目的：目前尚不清楚AIS合并DM时炎症消退是如何改变的，以及SPMS治疗是否有利于DM相关的AIS。在本研究中，我们旨在观察AIS合并DM患者炎症反应的变化，并检测RvD2的体内外治疗效果。

方法：用氧化低密度脂蛋白(OxLDL)刺激AIS患者和非AIS患者外周血单核细胞培养的巨噬细胞。分析细胞中SPM和炎症标志物的水平，评价RvD2对这些细胞的治疗效果。体内实验采用高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导C57BL/6J小鼠糖尿病模型。永久性大脑中动脉闭塞(PMCAO)后脑室注射RvD2建立AIS模型

结果：与不伴有DM的AIS患者相比，AIS合并DM患者的巨噬细胞SPM/白三烯B4(LTB4)比值降低，并伴有SPM合成酶15-脂氧合酶-1的表达降低。此外，AIS合并DM患者的促炎途径标志物水平升高，巨噬细胞偏向M1极化。在小鼠中，RvD2治疗改善了pMCAO引起的脑损伤、神经功能障碍和炎症反应。此外，RvD2通过促进巨噬细胞/小胶质细胞极化促进体内外M2表型的分解来挽救炎症的消退。

图1 DM+AIS组PAGE 18/26和MaR1~LTB4均低于DM组和非DM+AIS组，而非DM+AIS组与CON组无差异。(2)DM+AIS组血浆15-LOX-1水平低于DM组和非DM+AIS组，而5-LOX水平在4组间无明显差异。AIS组与非AIS组比较采用Mann-Whitney U检验，四组间比较采用方差分析和土耳其后验。误差条表示平均值±扫描电子显微镜。*p<0.001.0 5，**p<0.0 1，*p<0.0 1，ns=不显著㼿不能。AIS，急性缺血性卒中；CON，对照组；DM，糖尿病；EIA，酶免疫分析；LTB4，白三烯B4；LXA4，脂氧素A4；MaR1，MAXE1；OX-LDL，氧化型低密度脂蛋白；PBMC，外周血单核细胞；RvD1，解析蛋白D1；RvD2，解析蛋白D2；WB，免疫印迹。临床患者PBMC经氧化低密度脂蛋白处理后巨噬细胞SPM及其合成酶的水平。从患者的PBMC中分离出巨噬细胞，用ox-LDL处理24小时。收集培养上清液用于EIA分析脂类介质，收集细胞用于WB分析SPM合成酶。(1)AIS组SPM/LTB4比值低于非AIS组。进一步分析显示，Rvd1、RvD2

图2临床患者外周血单核细胞经氧化低密度脂蛋白处理后的巨噬细胞M1/M2表型及其他㼿炎症途径标志物的变化。(A)Western印迹分析显示，DM+AIS组巨噬细胞CD206的表达低于DM组和非DM+AIS组。而DM+AIS组与DM组比较，以及非DM+AIS组与CON组比较，iNOS表达均增加。作为表型分化的综合标志，DM+AIS组PAGE 20/26 CD206/iNOS比值明显低于DM组和非DM+AIS组。(2)MAPK/NFκB通路标志物分析显示，DM+AIS组的p-p38/p38和p-p65/p65比值高于DM组和非DM+AIS组，而p38和p65的总水平在四组间无明显变化。

图3 RvD2对pMCAO诱导的糖尿病小鼠神经功能及病理改变的治疗作用。(A)神经学测试显示，糖尿病可降低pMCAO后小鼠的握力测试成绩，提高mNSS的Page 23/26评分，而RvD2治疗可挽救pMCAO后DM和非DM小鼠的上述损害。(2)结晶紫染色显示pMCAO后DM小鼠脑梗塞体积增大，RvD2治疗后DM小鼠和非DM小鼠脑梗塞体积均缩小。梗死区用虚线圈出。(C)免疫㼿荧光染色显示，DM可减少梗死区存活神经元的数量，而给予RvD2治疗后，DM和非DM小鼠的存活神经元数量均增加。切片用Neun(红色)标记神经元，DAPI(蓝色)反染色检测细胞核。采用方差分析，然后是土耳其的事后分析。误差条表示平均值±扫描电子显微镜。*，p<0.001。NS=Not Signi㼿Can.。RvD2，Resolvin D2；DM，糖尿病；pMCAO，永久性大脑中动脉闭塞。

图4 RvD2对经pMCAO攻击的糖尿病小鼠MAPK/NFκB通路标志物的治疗作用。(A)经Western blotting分析的代表性条带。(2)Western blotting定量㼿阳离子分析显示，DM使pMCAO后小鼠脑内p-p38和p-p38/p38比值以及p-p65和p-p65/p65比值升高，而rvD2治疗降低了这些指标在㼿炎症通路标志物中的水平。采用方差分析，然后是土耳其的事后分析。误差条表示平均值±扫描电子显微镜。*p<0.001；*p<0.001。

结论：我们的数据显示糖尿病损害了AIS患者的炎症消退，暗示了DM相关的AIS中未消退炎症的新机制。此外，RvD2促进巨噬细胞/小胶质细胞的炎症消退，保护DM相关的AIS，因此可能成为一个新的治疗靶点。

原文出处：Tang X,  Liu L,  Miao Z, et al.Resolution of inflammation is disturbed in acute ischemic stroke with diabetes mellitus and rescued by resolvin D2 treatment.Free Radic Biol Med 2022 Jun 21;188